Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

DNA ladderが検出できず トピック削除
No.2885-TOPIC - 2010/07/14 (水) 17:52:34 - 時の君
はじめまして
今、PC12細胞を飢餓培養し、アポトーシス誘導を行い、DNA ladderで確認する試験を行っているのですが、電気泳動後バンドが全然写っていません。
もちろんマーカーは写っています。
私としてはDNAの溶出がうまく行えていないか、アポトーシス誘導が行えていないかと考えています。
以下にプロトコールを記します。


普段は、PC12細胞を10％FBS、10％HSのGultaMAXのDMEM培地、10cmディッシュで培養しています。
飢餓培養時はで6ウェルプレートに1×10^6、もしくは5×10^5という高濃度で播種し、24時間培養後1％FBS、1％HSのNoGlucoseのDMEM培地に置換し、24時間、48時間後に細胞を回収します。
回収した細胞について
@PBSでWashした細胞（細胞全て←これまずいですかね？）を1.5mlエッペンにて遠心分離後、300μlのPBSでピペッティングし、ボルテックスしながら700μlのEtOHを添加
A−20℃でO/N
B14000rpm、4℃、5分で遠心後、上清を除去し、PCBを40μl加えてピペッティングし20分室温でインキュベート
B14000rpm、4℃、5分で遠心後、上清を別の1.5mlエッペンに移す。
CRNase A　2μlを加え、37℃で60分間インキュベート
DProteinaseK　2μlを加え、37℃で60分間インキュベート
E電気泳動　50V　1時間

PCB　リン酸クエン酸緩衝液
　(　pH7.8；　0.2M Na2HPO4　：0.1M citric acid =　192μl　：　8μl　)
再保存しないで分注して冷凍保存

回収した細胞を全て使用しているのが悪いのですかね？
書籍｢アポトーシス実験法｣やネットや過去ログを調べているのですが、どうしたらいいか分からなくて困っています。
どうかよろしくおねがいいたします・・・
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.2885-9 - 2010/07/20 (火) 09:22:18 - ポジコンを
PC12細胞に添加してアポトーシスを誘導できる薬剤は多数報告されていると思います。

そういうものをポジコンとして２、３種類用意してみては？

(無題) 削除/引用
No.2885-8 - 2010/07/20 (火) 08:20:48 - だから
＞しかしリン酸クエン酸緩衝液処理を行い、断片化したDNA溶出ではDNA ladderの検出は出来ないのですか？

ポジコンは？

(無題) 削除/引用
No.2885-7 - 2010/07/16 (金) 11:01:16 - 時の君


コメント、アドバイスありがとうございます。

ちょっと質問変えます
以下のURLの
http://miuse.mie-u.ac.jp:8080/bitstream/10076/10585/1/50C12501.pdf
3ページ目(38ページ)の2.FCM解析でリン酸クエン酸緩衝液処理を行い、断片化したDNA溶出を行った
と書かれています。この場合はFCM解析ですが、この方法でDNA抽出を行おうと考えてしまいました。
さらに下に3.DNA ladderの検出ではLysis bufferを用いています。こっちが一般的で今後はこの方法でやろうと思います。
しかしリン酸クエン酸緩衝液処理を行い、断片化したDNA溶出ではDNA ladderの検出は出来ないのですか？
変な質問していると思いますが、調べても分からなくて困っています。参考URLだけでも教えていただけたら幸いです。宜しくお願いいたします。

もうしわけありません 削除/引用
No.2885-6 - 2010/07/16 (金) 09:53:13 - 時の君
コメント、アドバイスありがとうございます。

ちょっと質問変えます
以下のURLの
3ページ目(38ページ)の2.FCM解析でリン酸クエン酸緩衝液処理を行い、断片化したDNA溶出を行った
と書かれています。この場合はFCM解析ですが、この方法でDNA抽出を行おうと考えてしまいました。
さらに下に3.DNA ladderの検出ではLysis bufferを用いています。こっちが一般的で今後はこの方法でやろうと思います。
しかしリン酸クエン酸緩衝液処理を行い、断片化したDNA溶出ではDNA ladderの検出は出来ないのですか？
変な質問していると思いますが、調べても分からなくて困っています。参考URLだけでも教えていただけたら幸いです。宜しくお願いいたします。

もうしわけありません 削除/引用
No.2885-5 - 2010/07/16 (金) 09:41:25 - 時の君

(無題) 削除/引用
No.2885-4 - 2010/07/15 (木) 11:05:28 - ポジコンを
まずはポジティブコントロールを用意しないとなにも始りません。

(無題) 削除/引用
No.2885-3 - 2010/07/15 (木) 10:20:24 - 異伝子
学生なら先生に聞け。
ここで聞いてもいいとは思うが、せっかく払っている授業料が無駄。
まず調べる。次に先生に聞く。それでもだめならここなどで聞いてみる。

(無題) 削除/引用
No.2885-2 - 2010/07/14 (水) 17:59:37 - やれやれ
ラダーが見えていないだけなのか？
ちゃんとしたゲノムは見えているのか？

アポトーシスの誘導が出来ているのかということ。

DNA ladderが検出できず 削除/引用
No.2885-1 - 2010/07/14 (水) 17:52:34 - 時の君
はじめまして
今、PC12細胞を飢餓培養し、アポトーシス誘導を行い、DNA ladderで確認する試験を行っているのですが、電気泳動後バンドが全然写っていません。
もちろんマーカーは写っています。
私としてはDNAの溶出がうまく行えていないか、アポトーシス誘導が行えていないかと考えています。
以下にプロトコールを記します。


普段は、PC12細胞を10％FBS、10％HSのGultaMAXのDMEM培地、10cmディッシュで培養しています。
飢餓培養時はで6ウェルプレートに1×10^6、もしくは5×10^5という高濃度で播種し、24時間培養後1％FBS、1％HSのNoGlucoseのDMEM培地に置換し、24時間、48時間後に細胞を回収します。
回収した細胞について
@PBSでWashした細胞（細胞全て←これまずいですかね？）を1.5mlエッペンにて遠心分離後、300μlのPBSでピペッティングし、ボルテックスしながら700μlのEtOHを添加
A−20℃でO/N
B14000rpm、4℃、5分で遠心後、上清を除去し、PCBを40μl加えてピペッティングし20分室温でインキュベート
B14000rpm、4℃、5分で遠心後、上清を別の1.5mlエッペンに移す。
CRNase A　2μlを加え、37℃で60分間インキュベート
DProteinaseK　2μlを加え、37℃で60分間インキュベート
E電気泳動　50V　1時間

PCB　リン酸クエン酸緩衝液
　(　pH7.8；　0.2M Na2HPO4　：0.1M citric acid =　192μl　：　8μl　)
再保存しないで分注して冷凍保存

回収した細胞を全て使用しているのが悪いのですかね？
書籍｢アポトーシス実験法｣やネットや過去ログを調べているのですが、どうしたらいいか分からなくて困っています。
どうかよろしくおねがいいたします・・・
全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を