Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム | このフォーラム | ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

GFP融合ベクターの作製 トピック削除
No.2882-TOPIC - 2010/07/14 (水) 13:41:08 - ライゲーションマスター
pAcGFP1というベクターのN末のマルチクローニングサイトに、

目的のタンパク質をライゲーションして、GFP融合タンパク質発現ベクターの作製を行っています。

ライゲーション後、エタ沈、形質転換し、IPTG/Xgal、Amp(+)LBプレートに播いてブルーホワイトセレクションで、セレクションしようと考えています。

そこで疑問に思ったのですが、蛍光タンパク質でブルーホワイトセレクションは可能なのでしょうか?

融合プラスミド→緑色のコロニー(GFPが発現するため)

セルフライゲーション→青+緑色のコロニー(GFPとβガラクトシダーゼが発現するため)

GFP融合タンパク質の発現効率が下がったら、白色のコロニーが出来ると思うのですが。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



22件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


(無題) 削除/引用
No.2882-22 - 2010/07/15 (木) 13:58:50 - やれやれ
>しかし、GFPを発現するプラスミドの場合は、この白いコロニーは緑色になってしまうのではないかと思いました。また、インサートが導入されていないプラスミドは青いコロニーになると思うのですが、この場合もGFPが発現してしまうのではないかと思いました(セルフライゲーションなどして、もとのプラスミドに戻ってしまうため。よって、青い一つのコロニーに青色と緑色が混じったコロニーが出来ると考えました)。

だから、

緑色に肉眼で見える「こともある」という現象です。
それをあてにしてセレクションなんてしません。

そもそも、GFPはどうして光るのか知ってます??
励起光を当ててはじめて緑色に光るのですよ。
普通の光の元で緑色に見えるのは、
可視光の中にもその励起光にあたる光があって、しかし、それは弱い
のにも関わらず緑色に見えるというのは、
発現したGFPの量が「超多量」にあるから「たまたま緑に見える」だけなのですよ。

>青い一つのコロニーに青色と緑色が混じったコロニーが出来ると考えました)。
>MCSにインサートを導入して形質転換した場合もコロニーは緑色になるものなのでしょうか?

わかりますか?何言っているのか?

仮に、緑色が見えたとして、その「緑色」と
カラーセレクションで出てくる「青色」は

「色の質」というか、まったく違うのです。

単に色の質を語るならば、蛍光ペンの緑色と
油性マジック、または絵の具の濃い青色を想像してみなさい。

丸い円を二つの色で塗ってご覧なさい。
確実に青色の方が、勝つでしょう!!!

そもそもイレギュラーで当てにしてはならない「緑色」
そしてその緑よりも遥かに濃く、濃くなくても異質な色である青色
それについてどうこう言っているのですよ、あなたは。

基本を勉強しなさいって。
はぁ疲れました。

(無題) 削除/引用
No.2882-21 - 2010/07/15 (木) 12:07:21 - スケプティスト
> MCSにインサートを導入して形質転換した場合もコロニーは緑色になるものなのでしょうか?

ケースバイケースなので何とも言えません。確かに言えることは、そのような基準で発現プラスミドの構築を行うべきではないということです。

すみません 削除/引用
No.2882-20 - 2010/07/15 (木) 11:54:49 - ライゲーションマスター
最後に質問させて頂きたいのですが、

MCSにインサートを導入して形質転換した場合もコロニーは緑色になるものなのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.2882-19 - 2010/07/15 (木) 03:11:06 - gg
全てのベクターでブルーホワイトセレクションができると思ったら大間違いです。
LacZとIPTG/X-galの組み合わせで、ブルーホワイトセレクションが成り立ちます。
つまり、pAcGFP1にLacZがのっていないんで、ブルーホワイトセレクションできないんですよ。

もっと勉強しなさい。

(無題) 削除/引用
No.2882-18 - 2010/07/15 (木) 01:52:00 - ああああ
えっと、pAcGFP1でブルーホワイトセレクションをしたいという話ですか?

皆さんに指摘されていますが、pAcGFP1にはlacZのプロモーターとオペレーターと開始コドンから数残基しか入ってません。
つまり、このlacZはαフラグメントではないのでωフラグメントと相補されず、ブルーホワイトセレクションには使えません。
マニュアルにはちゃんと書いてありますので読んでください。

そういうことではなくて、pAcGFP1ではない蛍光タンパク質とlacZをコードする別のプラスミドの話ですか?
それはやってみないとわからないと思います。
興味があるなら、プラスミドを作って自分で調べてみてはどうでしょうか?

お騒がせしてすみません 削除/引用
No.2882-17 - 2010/07/15 (木) 01:03:16 - ライゲーションマスター
>やれやれさん

だから

>>そこで疑問に思ったのですが、蛍光タンパク質でブルーホワイトセレクションは可能なのでしょうか?
融合プラスミド→緑色のコロニー(GFPが発現するため)
セルフライゲーション→青+緑色のコロニー(GFPとβガラクトシダーゼが発現するため)
GFP融合タンパク質の発現効率が下がったら、白色のコロニーが出来ると思うのですが。

私には、これ自体、何を言っているのかわかりません。

ちゃんとカラーセレクションについて基本を押さえることから始めましょうよ。


私の理解としてはブルーホワイトセレクションは、「プラスミドにインサートが導入されると白いコロニーができて、インサートが導入されていないと青いコロニーできるというものです。」
しかし、GFPを発現するプラスミドの場合は、この白いコロニーは緑色になってしまうのではないかと思いました。また、インサートが導入されていないプラスミドは青いコロニーになると思うのですが、この場合もGFPが発現してしまうのではないかと思いました(セルフライゲーションなどして、もとのプラスミドに戻ってしまうため。よって、青い一つのコロニーに青色と緑色が混じったコロニーが出来ると考えました)。

(無題) 削除/引用
No.2882-16 - 2010/07/15 (木) 00:21:50 - 通りがかり
> 青の遺伝子はプラスミドにはありますが.....

やれやれ...(脱力)

(無題) 削除/引用
No.2882-15 - 2010/07/14 (水) 21:43:03 - take_
No.2882-4の通りがかりさんのおっしゃる意味が分からないので、マップを見ました。
GFP っていうと、哺乳動物細胞に入れて観るのかと思ってたら、www.clontech.com/images/pt/PT3715-5.pdf
こんなベクターがあるのですね。

青の遺伝子はプラスミドにはありますが.....
上記の説明書をよく読みましょう。
たしかに、マップの下の配列やその続きを「さらっ」と見ると、早とちりしそうです。

それにしても、マップの3' MCSっていう標記は、引っかけだなぁ。
「GFPの後ろに入っているのに目的タンパクができません。でも光ります」
っていう質問が来そう。

(無題) 削除/引用
No.2882-14 - 2010/07/14 (水) 21:13:45 - モモ
まあ、結果を恐れずにやってみるのが早いんじゃないでしょうか?
次の日には結果が出る実験ですよね。

私の想像ですが、インサートが入るとGFPの発現が減るので、色が薄くなって問題なくセレクションできるのでは、と思います。

(無題) 削除/引用
No.2882-13 - 2010/07/14 (水) 17:44:06 - やれやれ
だから

>>そこで疑問に思ったのですが、蛍光タンパク質でブルーホワイトセレクションは可能なのでしょうか?
融合プラスミド→緑色のコロニー(GFPが発現するため)
セルフライゲーション→青+緑色のコロニー(GFPとβガラクトシダーゼが発現するため)
GFP融合タンパク質の発現効率が下がったら、白色のコロニーが出来ると思うのですが。

私には、これ自体、何を言っているのかわかりません。

ちゃんとカラーセレクションについて基本を押さえることから始めましょうよ。

(無題) 削除/引用
No.2882-12 - 2010/07/14 (水) 16:01:44 - AP
>>の「βガラクトシダーゼ」は、プラスミドのどの部分に存在するんでしょう?

>lacZのことでした。

いやいや、そういうことではなくて、、、、
とっちらかってるみたいですから、まず落ち着いて、説明書をよく読んでからでなおしては、

(無題) 削除/引用
No.2882-11 - 2010/07/14 (水) 16:01:02 - 通りがかり
> lacZのことでした。

で、それはどこに?

ごめんなさい 削除/引用
No.2882-10 - 2010/07/14 (水) 15:49:33 - ライゲーションマスター
>の「βガラクトシダーゼ」は、プラスミドのどの部分に存在するんでしょう?

lacZのことでした。

(無題) 削除/引用
No.2882-9 - 2010/07/14 (水) 15:42:50 - 通りがかり
> 特に、ブルーホワイトセレクションができないとはどういった意味なのでしょうか?

逆に聞きますけど、

> GFPとβガラクトシダーゼ

の「βガラクトシダーゼ」は、プラスミドのどの部分に存在するんでしょう?

(無題) 削除/引用
No.2882-8 - 2010/07/14 (水) 15:33:23 - ファング
ベクターに挿入した遺伝子断片が発現してしまうことで、大腸菌に対して毒性を
もたらすことが少なからずあります。
なのでプラスミド構築時にあえて誘導をかけることは普通はしません。

青白セレクションが発明された時は画期的だったと思いますが、それをすることで
作りたいコンストラクトを持つクローンのコロニーが生えてこないことは珍しく
ないと教わりました。
今や学生実験でのデモンストレーションくらいにしか使われてないのでは。

(無題) 削除/引用
No.2882-7 - 2010/07/14 (水) 15:27:56 - やれやれ
>この系に関しての知識が乏しいので、おっしゃている意味がよくわからないのですが、もう少し詳しく教えて頂けませんか?

まず、基本的な知識をちゃんとつけましょう。

>購入したプラスミドを形質転換したところ、肉眼で緑色になるくらい発現しました。

そんな風に肉眼で見える「こともある」という現象です。
それをあてにしてセレクションなんてしません。

>そこで疑問に思ったのですが、蛍光タンパク質でブルーホワイトセレクションは可能なのでしょうか?
融合プラスミド→緑色のコロニー(GFPが発現するため)
セルフライゲーション→青+緑色のコロニー(GFPとβガラクトシダーゼが発現するため)
GFP融合タンパク質の発現効率が下がったら、白色のコロニーが出来ると思うのですが。

私には、これ自体、何を言っているのかわかりません。

(無題) 削除/引用
No.2882-6 - 2010/07/14 (水) 15:09:04 - AP
>セルフライゲーション→青+緑色のコロニー(GFPとβガラクトシダーゼが発現するため)

そう言うデザイン・構造になっていないことはベクターのマップ、添付資料、記載を読めばわかることですよ。形質転換体のプレーティングの手順のにIPTGとかX-galもないと思いますが。

(無題) 削除/引用
No.2882-5 - 2010/07/14 (水) 14:48:51 - ライゲーションマスター
>TK-1さん

購入したプラスミドを形質転換したところ、肉眼で緑色になるくらい発現しました。

>ファングさん、通りがかりさん

この系に関しての知識が乏しいので、おっしゃている意味がよくわからないのですが、もう少し詳しく教えて頂けませんか?
特に、ブルーホワイトセレクションができないとはどういった意味なのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.2882-4 - 2010/07/14 (水) 14:40:54 - 通りがかり
そもそも lacZ 遺伝子に由来する部分は ATG 以下数アミノ酸だけなので、酵素活性なんてないですし、ブルーホワイトセレクションもできません。

(無題) 削除/引用
No.2882-3 - 2010/07/14 (水) 14:33:34 - ファング
発現プラスミドを構築する際に、プロモーターの誘導なんて考えない方がいいですよ。

22件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を