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形質転換 トピック削除
No.2875-TOPIC - 2010/07/13 (火) 12:57:15 - cell
ライゲーション後のプラスミドを形質転換しようと考えているのですが、

その際に用いる大腸菌は、BL21(DE3)のようなタンパク質発現で良く用いられるコンピでも良いのでしょうか？

それともJM109やDH5αのようなプラスミドの精製でよく用いられるコンピでもいいのでしょうか？この場合購入しないといけないのです・・・

今年から実験を始めたばかりで困っています。やってみることが一番早く済むかもしれないのですが、あまり無駄遣いできないもので。
　
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No.2875-13 - 2010/07/14 (水) 18:31:40 - スケプティスト
あなただと思っていましたよ、ライゲーションマスターさん。

ブルーホワイトセレクションのことは忘れましょうよ。

なるほど 削除/引用
No.2875-12 - 2010/07/14 (水) 17:38:09 - ライゲーションマスター
やはり、BL21はタンパク質発現用のコンピテントセルのようですね。

ちなみに、BL21ではカラーセレクション（ブルーホワイトセレクション）は出来ないですよね？

(無題) 削除/引用
No.2875-11 - 2010/07/14 (水) 16:19:48 - スケプティスト
時間って言ったって実労半日も掛からないで半年分は出来るんですから、コンストラクションに失敗して何日も遅れることを考えたら自作した方が結局早いと思いますよ。お金があるならもちろん買っても良いです。

(無題) 削除/引用
No.2875-10 - 2010/07/14 (水) 15:23:39 - う
詳しいことはわかならいですが、経験則で。

BL21には、タンパク質を発現させようとするとき、直前しか、プラスミドを導入しない。
変なことになることが多いから。
プラスミドの回収が少なかったり、なんか妙なことが起こることがおおい。
そして、BL21にプラスミドを入れてしばらく（感覚的に中長期）飼ったものを
増やしてタンパク質を発現させても、うまくいかないことが多い。

などなど、感覚としてBL21は特殊だなぁと思う。

ので、私はBL21はタンパク質がらみしか使わない。

(無題) 削除/引用
No.2875-9 - 2010/07/14 (水) 14:41:57 - ファング
サブクローニンググレードのコンピテントセルって1万円くらいですよね。
後々に起こりうる面倒なことを考えると、1万円は高くないと思うのですが。

ありきたりの大腸菌株の研究者間の譲渡なら無償でするのが習慣ですので、
株の入手はつてをたどればそれほど難しくありません。
お金はないけど時間がある状況なら自分でコンピテントセルを作れるように
なっていれば、消耗品費の節約にはなります。

(無題) 削除/引用
No.2875-8 - 2010/07/14 (水) 14:14:55 - TK-1
BL21ってrecA(-)なんですかね。

(無題) 削除/引用
No.2875-7 - 2010/07/14 (水) 13:47:13 - スケプティスト
急がば回れ

ありがとうございます。 削除/引用
No.2875-6 - 2010/07/14 (水) 13:29:57 - cell
BL21(DE3)で形質転換してみようと思います。

今年から実験を始めたばかり分からないことだらけです。

みなさまありがとうございます。 削除/引用
No.2875-5 - 2010/07/14 (水) 13:26:46 - cell

(無題) 削除/引用
No.2875-4 - 2010/07/13 (火) 23:03:02 - take_
標準的なホスト大腸菌なら、国立遺伝研のバンクに無いか？
お金をかけられないなら、コンピを野島先生の方法で自作すれば良い。

ぼくが学生のころ居たラボは、最初の関門が共通で使うコンピの作製でした。

(無題) 削除/引用
No.2875-3 - 2010/07/13 (火) 18:04:47 - ~
クローニング用の大腸菌がなく、タンパク質発現用の大腸菌のみを持っている状況が理解できません。

>その際に用いる大腸菌は、BL21(DE3)のようなタンパク質発現で良く用いられるコンピでも良いのでしょうか？
BL21(DE3)などの場合、クローニング用の大腸菌と比較して1桁以上 形質転換頻度が落ちると思います。
それでも目的のクローンが得られることが期待できるライゲーションを行なっているのであれば、BL21(DE3)”でも”いいと思います。

>それともJM109やDH5αのようなプラスミドの精製でよく用いられるコンピでもいいのでしょうか？
なぜ、”でも”がついているのか分かりません。
こちらが標準的なプロトコルとなると思います。

(無題) 削除/引用
No.2875-2 - 2010/07/13 (火) 16:21:11 - さく
クローニングにはJM109やDH5αといった株が良いでしょう。
BL21(DE3)は上記に比べて形質転換効率が悪いと言われています。
学生さんですか？こんなとこで聞くより、先生に相談する方が良いと思います。

形質転換 削除/引用
No.2875-1 - 2010/07/13 (火) 12:57:15 - cell
ライゲーション後のプラスミドを形質転換しようと考えているのですが、

その際に用いる大腸菌は、BL21(DE3)のようなタンパク質発現で良く用いられるコンピでも良いのでしょうか？

それともJM109やDH5αのようなプラスミドの精製でよく用いられるコンピでもいいのでしょうか？この場合購入しないといけないのです・・・

今年から実験を始めたばかりで困っています。やってみることが一番早く済むかもしれないのですが、あまり無駄遣いできないもので。
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