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(無題) 削除/引用 No.2874-10 - 2010/07/13 (火) 22:57:41 - take_ 最初からDNA は、ごく少量だったのではないでしょうか？ シッポ5 mm だと、十分量のDNA は取れるのは知っていますけど。 DNA 以外の夾雑物が見えていただけで、2回目のエタ沈では 本当にDNA だけがごく少量沈でんした？ あるいは、DNA が最初のイソプロ沈のあとで溶けきってなく、 その上清でエタ沈したとか。 取ってから、どのくらい置いていたか知りませんが、DNase で、 壊れちゃったとか？ やばそうなときには、ぼくは遠慮なくエタ沈メイトを入れてますけど。

(無題) 削除/引用 No.2874-9 - 2010/07/13 (火) 15:32:41 - 中年 極端な高分子量のDNAが高い濃度であると、アルコール沈殿しようとするとDNAがローカルに析出してゲル様の構造を取ってしまい、全体が混合されにくくなることがあるように思います。DNA溶液を全体で500μl程度に希釈してからアルコール沈殿をやってみることを試してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2874-8 - 2010/07/13 (火) 14:50:23 - 774 確かに最初のイソプロ沈じゃあ夾雑物は除けないですよね。 すぐにというわけにはいきませんが、次回トライしてみます！

(無題) 削除/引用 No.2874-7 - 2010/07/13 (火) 14:38:13 - AP なにかタンパク質か多糖類がcoagurateしているように思えます。当初は流動性だった溶液でも凍結したり加熱したりすることでcoagurateを起こすことはあり得ます。アルコール沈殿する前に一旦希釈して、フェノール抽出してみては。

(無題) 削除/引用 No.2874-6 - 2010/07/13 (火) 14:34:56 - bluehornet 酢酸ナトリウムについては問題ないとする（僕なんかは何年も前の物を使ってますが問題なしです）と、やはり夾雑物（おそらく蛋白）が原因だと思われます。 最初のイソプロ沈時に多量の蛋白消化物もペレット化しているんじゃないでしょうか？ サザンブロッティングを行うということですから、一度、フェノールクロロホルム抽出などを行ってサンプルを精製してみてはどうでしょう？ フェノールクロロホルム抽出後のサンプルは正常にエタ沈できると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2874-5 - 2010/07/13 (火) 14:34:30 - 774 ということは、エタ沈に適用できるDNA濃度には上限があるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2874-4 - 2010/07/13 (火) 14:31:32 - ats 「サンプルの粘性が高くなるばかりで」とあるので、酢酸ナトリウム（+アルコール）が足りないかも。

(無題) 削除/引用 No.2874-3 - 2010/07/13 (火) 14:01:44 - 774 試薬でイソプロパノール・エタノールは問題がないとすると、残っているのは酢酸ナトリウムですが、酢酸ナトリウムは3Mですよね？ サンプル側の問題としては夾雑物が考えられると思いますが、genotypingの際のイソプロ沈の前にフェノクロなどで除蛋白は行ってい 早速の回答ありがとうございます。 酢酸ナトリウムですが、作った時は３Mで作りました。作ってから半年以上経っていますが・・・ ちなみに、同じ酢酸ナトリウムで、少し前にエタ沈した時(プラスミドin TE bufferです)は問題はなかったです。 サンプルの除蛋白等は行っておりません。 しかし、最初のイソプロ沈の時にはしっかりとDNAが出てきており、イソプロ沈してDNAをDWに溶いて、それをもう一回エタ沈(イソプロ沈)を行うだけでDNAが出てこなくなるのか全く分かりません。 PCRに使うのは200μl中の1μlなので、そこに存在するDNA量は変わらないはずなのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.2874-2 - 2010/07/13 (火) 13:30:26 - bluehornet 試薬でイソプロパノール・エタノールは問題がないとすると、残っているのは酢酸ナトリウムですが、酢酸ナトリウムは3Mですよね？ サンプル側の問題としては夾雑物が考えられると思いますが、genotypingの際のイソプロ沈の前にフェノクロなどで除蛋白は行っていますか？

エタ沈・イソプロ沈でDNAが凝集しない 削除/引用 No.2874-1 - 2010/07/13 (火) 11:59:18 - 774 いつもお世話になっています。 初歩的な間違いをおかしていたら非常に申し訳ないのですが、調べた範囲では理由が分からず困っているのでアドバイスをよろしくお願いします。 エタ沈・イソプロ沈についてです。 ルーチンでマウスのgenotypingを行っており、３週齢頃のマウスのtailの5mm程をProK・SDS(56℃)で処理した後、イソプロ沈(注：ここでは誰が見ても明らかな程DNAが凝集します)→７０％エタノールでwash、風乾→200μlのDWで溶かしてPCRに使用しており、ここまでは何の問題も生じていません。 問題なのはここからで、先日そのゲノムDNAを使用してサザンを行うため、エタ沈を行いました。200μlのDNAに20μlの酢酸ナトリウムを加え、そこにエタノール(間違えて７０%とかではないです)を2.5倍量加えて混ぜたところ、サンプルの粘性が高くなるばかりでDNAが全く凝集してきません。-80℃に保存後12000gで２０分遠心してもペレットが確認できないのです。 ちなみに、イソプロ沈(DNAと等量入れて混ぜました)を行っても結果は同じでした。 これにはどういう理由が考えられるのでしょうか？ 試薬の問題。 DNAの濃度の問題。 塩濃度の問題。 色々可能性を考え、調べたりサンプルで色々試してみたりしたのですが、やはりうまくいきません。 よろしくお願いします。

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