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(無題) 削除/引用 No.2861-13 - 2010/07/15 (木) 11:59:24 - スケプティスト 「GFPと融合タンパク質に切断」と最初にお書きになっていましたので、GFPがＮ末端側かと勘違いしていましたが、GFP-ubiquitin-目的タンパク質の形ならば、脱ユビキチン化酵素の働きでubiquitinのＣ末端側で効率よく切断されます。膜タンパク質に用いることのできるtwo-hybrid法であるsplit-ubiquitin法はこの酵素活性を利用したものです。

(無題) 削除/引用 No.2861-12 - 2010/07/14 (水) 22:13:40 - あかね はっきり覚えていませんが、C末のGとPの間で切断されたと思います。 2Aの後ろに開始コドンは入れる必要はありません。

2A切断部位 削除/引用 No.2861-11 - 2010/07/14 (水) 22:01:17 - GFP ちなみに、 切断部位はKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPのどこになるんでしょうか？ あかねさんも2番目のgeneの開始コドンATGを、2Aの後には入れてないのでしょうか？ いろいろ、役立つ情報を頂き、助かっています。ありがというございます。

(無題) 削除/引用 No.2861-10 - 2010/07/14 (水) 21:09:56 - あかね 切断効率は場合によるのかもしれませんね。 ちなみに私のコンストラクトではほぼ100%切断されているようです。

GFP-ubiquitin-目的タンパク質 削除/引用 No.2861-9 - 2010/07/14 (水) 20:45:08 - GFP 2A peptideの切断効率は高くないのですか？ ウイルス未使用でのiPS細胞の作製に用いられているようなので、割に高いのではと期待したのですが。 GFP-ubiquitin-目的タンパク質もお知らせいただきありがとうございます。とても興味があります。 ubiquitinは、その名の通り、(試薬などを加えずに)ユビキタスに作用(分解される)すると考えていいのでしょうか？ 目的タンパク質-ubiquitin-GFPの場合は、GFPは分解され、Ｃ末端側に余分なものが付いた目的タンパク質が残ると考えていいのでしょうか？ いろいろ、調べてみましたが、89AA程度の付加になるようですね。

(無題) 削除/引用 No.2861-8 - 2010/07/14 (水) 16:31:03 - GFP 早速のご返事ありがとうございます。 ribosomeの間違いでした。 Stem Cells. 2007 Jul;25(7):1707-12. Epub 2007 Mar 29. Efficient multicistronic expression of a transgene in human embryonic stem cells. の図１でIRESと比較して、2A-mediated translational skipとありましたので、同じribosomeがスキップしながら翻訳する解釈していました。 そこで、2番目のgeneの翻訳開始コドンが必要なのか疑問でした(たぶんいらなそうとは思いましたが)。 2番目のgeneの翻訳開始コドンとしてのATGは不要とのことで、2番目のgeneのはGFP変異体なので、機能的には問題なといと思いますので、ATGなしてコンストラクト設計しようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2861-7 - 2010/07/14 (水) 16:27:43 - スケプティスト それから2A peptideの切断効率はそんなに高くないので、GFP融合タンパク質の形で残ってしまうことが問題であるような系には適当ではないと思いますが、その点は大丈夫ですか？GFPのＣ末端側に余分なものが付いていて構わないなら、GFP-ubiquitin-目的タンパク質という形の融合タンパク質として発現するという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.2861-6 - 2010/07/14 (水) 16:13:39 - スケプティスト PolIIがスキップして翻訳する？IRESと混同してませんか（PolIIは転写ですが）。一続きのタンパク質として翻訳されながら、co-translationalに切れるんですから、翻訳開始コドンとしてのATGは不要です。ただし、Ｎ末端がMetであることがタンパク質の機能に必要である場合はあります。

PolIIがスキップして翻訳するってことなら、 削除/引用 No.2861-5 - 2010/07/14 (水) 16:11:36 - GFP PolIIがスキップして翻訳するってことなら、2番目のATGは必要ないと思うのでが？ コントラスト作製された方？どうしていましたでしょか？ 2A peptideはIRESにくらべ発現が良さそうなので、使用予定です。

2A Self-Cleaving Peptideの2nd_ATG 削除/引用 No.2861-4 - 2010/07/14 (水) 16:07:03 - GFP 2A Peptideで質問ですが、 ２Aの後ろに付ける2番目のgeneにはATGの開始コドンって必要なんでしょうか？ PolIIがスキップして翻訳するってことなら、 1番目のgeneの、２Aの直前にstopコドンを付けると2番目のgeneは発現しなくなるのはわかるのですが。

2A peptide 削除/引用 No.2861-3 - 2010/07/10 (土) 00:22:20 - GFP 早速のご返事ありがとうございます。 プラスミドでのiPS細胞作製に、2A peptideが貢献していたんですね。 IRESで、なんとかならないものか思案していたところでしたが、 2A peptideで検討してみます。 非常に有用な情報でした。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2861-2 - 2010/07/09 (金) 23:40:26 - あかね 2A peptide はどうですか？ Flag程度の短いペプチドで自己切断活性を持っています。 融合タンパク質間に2Aを入れておくと、翻訳直後に2A自身の活性で融合タンパク質間が切断されます。最近はIRESよりも効率がよいとしてよく(iPSとかに）使われています。 Good luck

ユビキタスな内在性酵素によるアミノ酸切断配列 削除/引用 No.2861-1 - 2010/07/09 (金) 21:26:59 - GFP GFP融合タンパク質を細胞内で、GFPと融合タンパク質に切断したいと考えています。Fluo4-AM体を切断するestraseのように、ユビキタスな内在性酵素によって切断されるアミノ酸配列を教えた頂けましたらと思います。 できたら、短い配列だと助かるのですが、 なお、融合タンパク質にしないとならないので、IRESは除外しています。

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