全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2858-8 - 2010/07/15 (木) 13:55:46 - mooo 返信が遅れて申し訳ありませんでした。 >酸素と金属イオン存在化でBSAの酸化が生じるようですよ。 初めて知りました。 確かに、インキュベート中の容器の中には空気が多く含まれておりました。 プロトコルだとBSAとGAの混合溶液が計20mlになるように分量が書かれていたのですが、 それでは15ml遠心管に入りきらないので10ml作製して、それを15ml遠心管に入れてインキュベートしていました。 しかし酸化のことを考えると20ml溶液にして、そこから遠心管に15ml分注していたのかもしれません。 また作製しなおしてみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2858-7 - 2010/07/12 (月) 00:13:38 - キレート 抗体と反応した、というその力価が以前の抗体と同じであれば抗原としては良いのでしょうが、気になったので。 酸素と金属イオン存在化でBSAの酸化が生じるようですよ。 そちらのプロトコルの詳細が不明ですが、インキュベートの状態は容器中の空気の割合が多くなっていませんか？ EDTAを加えない代わりに空気を少なくする、というプロトコルになっているのでは？ 空気の割合を極力少なくするか、窒素雰囲気下でおこなう、それかEDTAを加えるとか文献の通りにしてみては。

(無題) 削除/引用 No.2858-6 - 2010/07/11 (日) 16:07:40 - mooo >0.2MのSodium Phosphate Buffer 私も気になったのでSorensenの方法でPB(pH7.4)のものを作って それに0.15M NaClを加えたものと加えていないものを作成して使ってみたの ですが、なぜか沈殿してしまいだめした。それでも液体は茶色に近い色だったのでAGEはできてたのでしょうか？（沈殿も茶色でした。） >以前作ったときは、BSA5mg/mL, GA50mMでやっていました。 濃度は薄めですね。やはりBSAの終濃度25mg/mlだと濃いために糖化反応で BSA同士の架橋が多く起こって固まってしまうのでしょうか？ 濃度などにこだわらずにウェスタンで確認して大丈夫だったらそれでいいでしょうか？Day2で固まる前に反応をストップしたAGE2だと抗AGE2ポリクロAbには反応して抗AGE3ポリクロAbには何も出てません。また今度1/10濃度(BSAとGA)で作成したものに関しても確認する予定です。

(無題) 削除/引用 No.2858-5 - 2010/07/10 (土) 01:26:19 - CUB 以前作ったときは、BSA5mg/mL, GA50mMでやっていました。bufferはPBS(-)でも大丈夫でしたが、PBのほうが確かに無難だと思います。NaFとPMSFも入れていました。 透析後に吸引乾燥して再溶解して濃縮ストックをつくっていました。カラムでもいいと思います。先人の作成したプロトコールなので詳細不明ですが、わざわざ濃縮するのは同じようなトラブルがあったのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2858-4 - 2010/07/09 (金) 21:09:01 - キレート 理由は忘れましたけど、glyceraldehyde由来のAGEsを作製する際にBSAを溶かすbufferはPBSではなく、0.2MのSodium Phosphate Bufferだったと思います。 PBSでは緩衝能が弱く、maillard反応の進行に伴いpHがずれてしまうのかもしれませんね。

Re 濃度 削除/引用 No.2858-3 - 2010/07/09 (金) 15:39:38 - mooo BSAは50mg/ml、グリセルアルデヒド等は0.2Mです。 AGE1のグルコースのみ1M、3weeksインキュベートとなっています。 一応、十分の一の濃度では固まらずにできたのですが、以前に作られた人や論文では上記の濃度なので納得がいかない感じです。 また、EDTAなどのキレート剤は添加しておりません。

濃度 削除/引用 No.2858-2 - 2010/07/09 (金) 15:00:31 - キレート それぞれの濃度は？ あと、EDTA等は加えてないんでしょうか。

Advanced glycation end products(AGE)の作製 削除/引用 No.2858-1 - 2010/07/09 (金) 14:34:20 - mooo はじめまして。 初投稿させていただきます。 現在、約3年前に作製されたAGE2とAGE3を抗原として抗体の作製を行っているのですが、抗原の量がだいぶ減ってきているので自分でも作ろうとしました。 通常は液体なのですが、AGE1〜5までのうちグリセルアルデヒド由来のAGE2とグリコールアルデヒド由来のAGE3だけ毎回ゲル状になって固まってしまい困っています。 (AGE1はグルコース由来、AGE4はメチルグリオキサール由来、AGE5はグリオキサール由来。AGE1・4・5はうまくいってます。) 尚、作り方はBSA in PBS(-)とグリセルアルデヒドorグリコールアルデヒドin PBS(-)を同じ量混ぜ、フィルター滅菌して37℃で1weekインキュベートの後、透析にて作製完了です。固まってしまうのはインキュベート3日目前後です。 原因がわかる方、よろしくお願いします。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---