いつも参考にさせていただいております。
現在，ある微生物を感染させた時のマウス血中における
特異的抗体価を測定しようとELISAの系を立ち上げておりますが，
どうもうまくいきません。
そこでよろしければアドバイスを頂きたく思い投稿させていただきました。
（方法）
抗原をプレートへcoating (overnight 4℃）
↓ ブロッキング (blocker = TBS+1% skim milk)
↓ 室温，1時間
↓ 血清の添加（< 1/100 diluted with PBS or blocker)
↓ 室温，2時間
↓ 抗マウスIgG-HRP添加
↓ 室温，1時間
↓ 発色（TMB)
全てのステップ後にPBS+0.05％ Tween20による洗浄を行っています。
うまくいかないのは，ネガティブコントロールの血清（未感染マウス由来）を用いても，
発色してしまいバックが高くなってしまうことです。
血清を1000倍希釈で約1.5，25000倍希釈しても30分の発色時間で，
0.1ぐらいのODが出ます。
同時に行なった感染個体血清でもほぼ同じODです。
抗原を貼りつけていないWellでも殆ど同じODであったこと，
血清を添加しないWellでは全く（OD<0.01）発色しなかったこと，
よりブロッキングが不十分で，非特異的に吸着した血清成分（抗体？）に
抗マウスIgGが反応してしまったのだと考えております。
皆様は血清サンプルのELISAを行う際に，どのようなBlocking剤を用いていらっしゃいますか？
BSA, ゼラチン，化学合成ブロッカー等いろいろあると思いますが，
良好に動いている系がございましたら，教えていただきたく思います。
また，Blocker以外に改良すべき点がございましたら，教えていただきたく思います。
よろしくお願い致します。
|
|
このスレッドをはてなブックマークに追加