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(無題) 削除/引用 No.2856-7 - 2010/07/09 (金) 15:45:01 - ~ >死細胞断片に関しては、セルソーターは使えないのでficollを試してみようと思います。 細胞によっては、遠心のダメージで死ぬことがあります。 そのため、遠心に強い細胞だと事前に分かっていない場合は、 遠心をかけないディッシュも残しておくことをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.2856-6 - 2010/07/09 (金) 14:50:52 - 774 うさん、~さん、DDDさん、MPさん アドバイスありがとうございます。 ”クローン”の使い方がおかしい上、説明不足でした。 申し訳ありません。 最終的には”クローン”を得たいので、限界希釈を行う必要があることは理解しておりますが、今回は １）トランスフェクション効率がそれほど高くない ２）６種類の株を樹立する必要がある ので、いきなり限界希釈では膨大な数になるため、 まずセレクションによりbulkな状態の集団にしてから、限界希釈する予定でいました。 その過程で死細胞の影響が不安になったので質問させて頂いた次第です。 MPさんのアドバイスのようにやれば、クローンのかぶりの可能性も少なく効率よくできそうです。 死細胞断片に関しては、セルソーターは使えないのでficollを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2856-5 - 2010/07/09 (金) 14:14:20 - MP 皆さんの言われているように、クローンをとるなら96 well plateにまいてから選択を始めるのがよいと思います。あとは４−５日に一回液交換するだけ。ただplasmid transfectionだと安定株がとれる確率はかなり低いので、まく細胞を１well あたり10000, 3000, 1000, 300とかにふって（このへんは使う細胞や実験系にもよりますが）、最終的にまばらにpositive well がみられるplateからpick up するとよいです。死細胞の影響はがんがん増える細胞株なら考えなくてよいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2856-4 - 2010/07/09 (金) 13:07:33 - DDD 普通にクローン取るなら 私なら限界希釈法ですね。 死細胞の断片を除きたいとのことですが Ficollとか簡単でいいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2856-3 - 2010/07/09 (金) 12:54:12 - ~ １）死細胞の断片と一緒に培養していると、生細胞にも影響がありますか？ 生細胞も死んでしまうことはあります。 ２）死細胞の断片を除くできるだけ簡便な方法はありますか？ 目的はクローンの取得でいいのでしょうか。 限界希釈法 軟寒天培地上でのコロニー形成 FACS などは目的に沿ったものだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2856-2 - 2010/07/09 (金) 12:30:47 - う よくわからないのは、陽性「クローン」を選択しているのですよね？ ＞2日に一度のメディウム交換の際には、遠心後の細胞を全て継代しています。 どうしてこんなことするのでしょうか？ 普通、96穴のプレートで１穴に１−２個（３−４個とかもありか）の細胞が入るように 計算して薬剤を加えた培地でクローンが増えてくるまで、 液を変えずに飼いますけども。

浮遊系細胞のセレクション 削除/引用 No.2856-1 - 2010/07/09 (金) 12:10:54 - 774 現在、浮遊系細胞の安定発現細胞株の樹立を試みています。 neo耐性遺伝子を持つプラスミドをトランスフェクションした後、 G418存在下（ネガコンが約1週間で死ぬ濃度）で培養してます。 2日に一度のメディウム交換の際には、遠心後の細胞を全て継代しています。 ネガコンはほぼ死滅し、陽性クローンが増えるのを期待しつつ継代を重ねている状況です。 ここで教えて頂きたいことがあります。 トランスフェクションしたdishでも死細胞の断片がたくさん見えるのですが、 １）死細胞の断片と一緒に培養していると、生細胞にも影響がありますか？ ２）死細胞の断片を除くできるだけ簡便な方法はありますか？ 120xg 3minの遠心ではほとんど除けていません。 希釈継代すると陽性クローンをロスしそうで躊躇してしまいます。 ご存じの方がいらっしゃいましたら、よろしくお願いいたします。

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