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わかりました 削除/引用 No.2842-5 - 2010/07/07 (水) 21:06:08 - ou UC様 ご親切に、具体的な回答をありがとうございます。 早速　参考にさせて頂き、新たに培養してみます。 サイトカインが失活している可能性はあります。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2842-4 - 2010/07/07 (水) 20:06:43 - UC >細胞数は10分の１に減ってしまうのは普通なのですね。 いや、一寸表現がまずかったですね。「普通ではない」です。異常です。こちらでは、Day 7の時点で、分化している集団は、新鮮PBMCで75%以上、凍結PBMCで70%です。ちなみに毎回、無刺激(サイトカインなし)のCD14+細胞もネガコンで培養するのですが、こちらはDay 3の時点で分化中のゲートに収まる集団(フローサイトメトリーで)が10%以下になります。サイトカイン刺激が如何に肝心かが分かります。 >なにか細胞株など使われましたか？ いや、普通の血液(healthy donor)からFicollでPBMC回収、その後、Miltenyi biotecのでCD14+を回収してます。 最初に書き込んだサイトカインの量が違ってました。GM-CSF 800 UI/ml、IL-4 1000 UI/mlです。いくつかプロトコールがあると思いますが、僕がルーチンでやっているのを簡潔に。 　Day 0 　　6-well plateで 2x10^6 per well, 2ml per wellのCD14+を培養。細胞数 1M なら12-wellの方が良いと思います。mediumはRPMI1640+10%FBS(抗生剤加)〜R10です。 　Day 3 　　3倍濃度のサイトカイン(GM-CSF/IL-4)を含んだR10 1mlを加えて、適度にピペッティング。適宜、FACS解析。 　Day 7 or Day 6 　　imDCの回収。RPMI1640で2回wash。細胞数カウント後は、mDCのために、LPS刺激など。24-48時間後にmDCを回収、その後の実験へ。 このプロトコールの特徴は、Day 3で、単にmediumを加えるだけで、細胞を回収して遠心、medium入れ替えなどをしない点ですかね。結構シンプルですが、きちんとワークします。参考になれば。 　後、お使いのサイトカインがワークするのは確実でしょうか？

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.2842-3 - 2010/07/07 (水) 11:33:23 - ou UC様 早速のアドバイスありがとうございます。具体的で大変参考になりました。CD14→iDC→mDCの培養がうまくいかなくて、ゆきずまっています。 細胞数は10分の１に減ってしまうのは普通なのですね。培養の仕方がまずいのかなと悩んでしました。 毎回私の血液や同僚の血液を採血して、単核球分離しautoMACSで分離しています。purityは95％以上ですが、そこからがうまくいきません。もっと練習したいのですが、１回の採血量も７ml必要なので、採血が負担になっています。 UCさんは、この実験を確立されるのに、どのようにされましたか？　なにか細胞株など使われましたか？

(無題) 削除/引用 No.2842-2 - 2010/07/07 (水) 02:23:09 - UC こんにちは。専ら CD14 -> imDC -> mDC の実験をやっています。同様にIL-4/GM-CSFを用いた方法です。IL-4は 500 U/ml、GM-CSFは800 U/ml使っています。Day3には、CD14+はほぼ消失、CD1aが陽性になります(Day3でmedium(RPMI1640+10%FBS)及びサイトカインの更新)。CD14はPBMCから磁気ビーズを用いて分離しています(purity > 95%)。ouさんの分離方法は如何でしょうか。以前のトピで、キットによる分離は細胞にダメージを与えるみたいな書き込みがあったと記憶していますが、手技の問題が大きいのかなぁと思っています。1x10^6 cellから十分量の細胞が分化しますので(因みに僕は6-wellプレートを使っています)。凍結PBMCと新鮮PBMCでは、(当然ですが)後者の方が効率よく分化します。 チェックポイントとしては、 1) 単球分離の段階で、細胞がヘタっている可能性。 2) IL-4/GM-CSFの品質(サイトカインなしだと細胞は死んでいきます) 3) CD1a抗体の品質 あたりでしょうか。「細胞数が10分の１」というのは普通ではないかなと。

単球から未熟樹状細胞への分化培養 削除/引用 No.2842-1 - 2010/07/06 (火) 23:39:41 - ou ヒト末梢血から単球を分離し、1x10*6 cell/ml, 1mlを12well のうちの1wellにまいて IL-4 500 U/ml, GM-CSF 50ng/ml 添加し、6日間培養していますが、毎回細胞数が10分の１に減ってしまいます。またCD14は消えますが、CD1aが陽性になりません。 アドバイス頂けませんでしょうか。お願いします。サイトカインはpepro techを使用しています。

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