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(無題) 削除/引用 No.2833-2 - 2010/07/05 (月) 23:17:06 - と考えている。 まず抗体がモノクロで抗原分子が膜蛋白質ということなので、エピトープがどこなのかが重要。特に(1)の場合。もし膜貫通領域とか細胞質領域だと細胞がインタクトだと抗体アクセス困難。ゆえに(1)は使えない。だから消去法的に一般的な方法である(2)になる。加えて蛋白質複合体を構成している場合、他のコンポーネントが抗体のエピトープへのアクセスに邪魔になるかもしれない。そういう事とか考えるとIPはできることならばIP可能なポリクロ抗体の方がいいと思う。 膜蛋白質はやさしいbufferだと難溶の場合もあり得るから可溶化時のデタージェントとかも強めのものも必要になるかもしれない。(この手の実験は、ターゲットがlysis buffer(抗体反応液）中でちゃんと溶けていないことには成り立たない。）でもこれは一方で抗原抗体反応や蛋白質複合体を不安定化させてしもうおそれもある。ただこの問題はDSPみたいな living cell で使える蛋白質クロスリンカーで乗り越えられる可能性はある。a)in vivo クロスリンクーb)SDSで可溶化ーc)Triton X or NP40入りbufferで希釈(SDS0.1%以下にする）ーd)遠心で不溶物除去ーe) IPみたいな感じ。

免疫沈降時の特異的抗体添加のタイミング 削除/引用 No.2833-1 - 2010/07/05 (月) 19:24:07 - fosjdo お世話になっております。 免疫沈降初心者です。 現在、膜貫通分子Ａに会合する分子を探索する目的で、 分子Ａ発現stableクローン細胞株と、分子Ａに対する モノクロを使用して免疫沈降をしようとしています。 ここでモノクロを添加するタイミングについて質問が あります。自分なりに３パターン考えたのですが、 （１）細胞を回収後、lysis bufferで細胞を溶かす前に ＰＢＳ中でモノクロを添加する。 （２）細胞を回収してlysisi bufferで溶解し遠心後の 上清にモノクロを添加する。 （３）（１）、（２）を組み合わせ、lysis bufferでの 溶解前後にモノクロを添加する。 になりました。その後はプロテインＧビーズを添加します。 プロトコール集を参考にしますと、（２）が一般的なのかなと 思うのですが、（１）のほうが余計な抗体は排除できて バッググラウンドが低くなるのかとも思います。ただ、（１） ですと、ネガティブコントロール抗体添加では何も認識されない ので、lysis buffer 中に添加するほうが良いでしょうか。

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