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(無題) 削除/引用 No.2829-5 - 2010/07/06 (火) 11:32:46 - cDNAライブラリー 皆様 大変迅速、有意義なレスありがとうございました。 やはりバイアスがかかりまくりになるのですね... stblにEPして寒天培地、30℃で、いくつかのクローンをピックアップしてインサートの多様性を確認という流れでいこうかと思います。 > えーと、もちろんストック取ってありますよね？ おひとが悪いですね。(苦笑) お恥ずかしながらご指摘の通りすっかりグリセロールストック採り忘れてしまいまして、ご質問させていただいた次第です。次は取り忘れのないよう、今から手の甲にマジックで書いておきます(笑)。 繰り返しですが皆様、有意義な情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2829-4 - 2010/07/05 (月) 16:25:45 - 中年 大量の寒天プレート上で増やすべきというのは皆さん仰っているとおりですが、新たにトランスフォーメーションし直す（クローン間の均質性を落とす危険がある）よりも、そのライブラリーを作製された時のグリセロールストックを使われるのが良いでしょう。 えーと、もちろんストック取ってありますよね？

(無題) 削除/引用 No.2829-3 - 2010/07/05 (月) 16:11:01 - 通りがかり その方法だとバイアスかかりまくりでしょうね。 ・transformation はケミカルではなく electroporation を使う（サイズによるバイアスがかかりにくい） ・液体培養でなくプレート上でコロニーを形成させる（大腸菌の生育度による差がつきにくい） ・３７℃でなく３０℃で培養（欠失が起こりにくい） ・SURE とか Stbl のような、組換えが起きにくい株を使う（レトロウイルスベクターではしばしば組換えや欠失が起きる） といった点に注意して増幅しています。 増やした後で何十個かクローンを拾って、インサートがまちまちである事を確認した方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2829-2 - 2010/07/05 (月) 16:02:35 - Pumpkin 液体培養をすれば確実にバイアスがかかります。増幅しやすいものはより増幅し、増幅しにくいものは淘汰されていくでしょう。 そのため、選択寒天プレート培地あるいは半固体培地により、プラスミドライブラリーを増幅するのが一般的と思います。

レトロウイルスライブラリーの増幅 削除/引用 No.2829-1 - 2010/07/05 (月) 13:49:46 - cDNAライブラリー お世話になっております。 先日、遺伝子クローニングの為にレトロウイルスベクターに組み込んだcDNAライブラリーを作製したのですが、そろそろプラスミドの量が少なくなってきました。そこで、ライブラリーの増幅を行おうかと思うのですが、単純に大腸菌にトランスフォームして大容量(500mlくらい)で液体培養、プラスミドを回収すればよいのでしょうか。 バイアスがかかってライブラリー構成が変わってしまうことを懸念しているのですが、みなさんはいかがされておられますか？

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