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(無題) 削除/引用 No.2828-8 - 2010/07/12 (月) 11:36:59 - 青猫 かよさま＞ご丁寧に教えてくださりありがとうございました。本当に、びっくりするくらい減らすのですね。かよさまの助言がなかったら検討しなかったと思います。まずはやってみます。今回は本当にありがとうございました！！

ＲＮＡの量 削除/引用 No.2828-7 - 2010/07/10 (土) 13:07:31 - かよ ＲＮＡを希釈するのはたいした手間はかからないですよ。わたしの系はランダムプライマーで酵素はSSIIでRNasinを使って（キットじゃないです）逆転写かけてます。ＤＳＳサンプルの場合は、20ngのＲＮＡでやってます（反応液のtotal volは50ul)。ＰＣＲには(ＲＮＡ量として)0.4ng持っていってます。でもこの間も書いたとおり、系によって違うと思いますから、段階希釈して予備実験をされるといいと思います。 ついでながら、ＬＣＭで採取したサンプルだと1ng以下でＰＣＲすることの方がほとんどですが、それでも特に問題はないので、0.4ngでもリアルタイムＰＣＲについては心配はいらないと思います。

ご返答ありがとうございました！ 削除/引用 No.2828-6 - 2010/07/09 (金) 17:21:22 - 青猫 DSSマウスの結腸サンプルでｍRNAをみるのはやはりなかなか課題が多いのですね。。。うーん、心配。。。 WBももちろん考えているのですが、正直コストと時間をかけてまでとらなければならないデータなのかなあとも思ってまして。炎症誘発の程度はサイトカイン以外でもMPO活性とか臨床症状などで評価しているので、自分としてはサイトカイン類のmRNA発現量はあくまで予備的なデータだと思っているのです。しかし、一般的に文献で多くに検討されている項目なのでやらないといけないのかなと思い、今苦労しています。 皆様のご意見を参考にして、mRNAの抽出をISOGENからカラム式のRNeasy Mini Kitにかえてみます。 あと、皆さんはmRNA抽出前にRNase対策はしていらっしゃいますか？(例えばRNAlaterなどでover night処理するとか。。) かよさま＞RNA濃度のことは初めて聞きました！次の検討の時に試してみます。系によって違うと思うのですが、かよさまの系では逆転写に持っていくRNA濃度をどの程度に設定しましたか？参考にしたいので差し支えなければ教えてくださいませんか？＞＜

RNAを減らします 削除/引用 No.2828-5 - 2010/07/05 (月) 21:28:24 - かよ わたしも同じ問題で困り果てまして、やってる人に教えてもらいました。ｃDNA合成にもっていくRNAを減らすと、トリゾルサンプルでもできます。 系によって若干違うと思うので、ご自分のサンプルでお試しください。わたしは段階希釈で最適濃度を決めました。びっくりするくらい減らさないとだめなんですが、でもリアルタイムなら問題ありません。 DSSの大腸サンプルの場合、RNA濃度を減らしていくと、CTの値が下がっていくんですが（通常はあがりますよね）、それが逆転する濃度があるんです。そこまで減らします。

(無題) 削除/引用 No.2828-4 - 2010/07/05 (月) 11:46:01 - よっしー RT-PCRでどのような情報を得たいのかはわかりませんが， たとえばIELやLPL，上皮細胞などに分画した後に，RT-PCRでもウェスタンでもすれば，もう少し詳しく発現パターンがわかるともいますが． そんな必要はないのかな？？？

(無題) 削除/引用 No.2828-3 - 2010/07/05 (月) 10:36:09 - TS 実際に私が実験していたわけではないですが。 やっぱりISOGEN、Trizol系はうまくいかないらしいですよ。 DSSが持ち込まれてか、RTかPCRがかからなくなるそうです。 カラムタイプの精製キットを使っている人がほとんどだと聞きましたし、 それに変更して解決した人も知っています。 ちょっとCostlyですが、試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2828-2 - 2010/07/05 (月) 10:30:15 - うーん 多くは腸管にいる免疫細胞を単離後にタンパクレベルで評価する場合が多いかなという印象持ってます。WBでいいのでは？

DSS大腸炎モデルマウスの大腸からのmRNA抽出 削除/引用 No.2828-1 - 2010/07/05 (月) 10:06:49 - 青猫 C57BL/6マウスに5%DSSを7日間投与して、腸管組織を破砕し、ISOGENにてmRNAを抽出し、oligo(dt)primerを使って逆転写しています。Real Time-PCRでサイトカインなどのRNA発現をみたいのですが、DSS投与マウスからはサイトカインだけでなく、β-actinもバンドがでません。 調べてみると、DSSはmRNAの抽出やRT反応を阻害してしまうということがわかり、そのため今までの抽出処理ではうまくいかなかったのかなと思っているのですが、今後具体的にどんな風にプロトコールを改善していけばいいのか悩んでいます。 そこでDSSマウスでの実験経験がある方に伺いたいのですが、皆さんはどんな方法でRNA抽出及び逆転写をしていましたか？ また、飼育スケジュールの最終日はDSS水から水にきりかえるべきなのでしょうか？かなり困っているのでご存知の方、よろしくお願いします。 （DSSが抽出及びRT反応を阻害するという内容の論文をご存知の方がいらっしゃいましたらそれに繋がる情報を教えて頂けると幸いです。探し方が悪いのかも知れませんが、何度探しても見つからないので。。。）

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