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(無題) 削除/引用 No.2818-9 - 2010/07/03 (土) 00:01:54 - GFP atsさん、どうもありがとうございます。こういった情報が欲しかったので、とても助かりました。１％SDSでも大丈夫と分かって安心しました。本番の実験に行こうと思います。 皆様どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2818-8 - 2010/07/02 (金) 18:31:37 - ats 今はDLできないかもしれませんが、EGFPのマニュアルから抜粋。 5. 化学薬品に対する安定性 GFP は、1% SDS や 8M 尿素などの穏やかな変性剤中や、グルタルアルデヒドまたはホルム ア ル デ ヒ ド 固 定 後 も 蛍 光 を 維 持 し て い ま す 。完 全 に 変 性 し た G F P は 蛍 光 を 発 し ま せ ん 。G F P は、カバーグラスを封じる幾つかのマニキュアに非常に敏感であるため(Chalfie ら、1994; Wang & Hazelrigg、1994)、顕微鏡観察用のスライドでカバーグラスを封じるには、溶融ア ガロースかラバーセメントを使用してください。蛍光は、線虫麻酔剤フェノキシプロパノー ルでも消失します(Chalfie ら、1994)。GFP の蛍光は、1% H2O2 や 1mM DTNB(5,5'- ジチ オ ビ ス [ 2 - ニ ト ロ 安 息 香 酸 ]) な ど の ス ル フ ヒ ド リ ル 試 薬 に よ り 、 不 可 逆 的 に 破 壊 さ れ ま す (Inouye & Tsuji、1994b)。多くの有機溶媒は中等度の濃度で蛍光を損なうことなく使用 できますが、吸収極大はシフトすることがあります(Robart & Ward、1990)。 GFP は無水エタノール中で完全に蛍光を喪失し、パラフィンまたはプラスチック包埋に必 要な完全な脱水には耐えられません。ただし、エタノール処理中も原形質膜に付着したまま であることから、EGFP-F は 95% エタノールで透過化した細胞でも無傷のまま残ります(第 5 章を参照)。 6. タンパク質の安定性 in vitro: GFP は、熱(Tm = 70°C)、アルカリ pH、洗剤、カオトロピック塩、有機溶媒、プロナーゼ 以外の一般的なプロテアーゼ等に非常に耐性があります(Bokman & Ward、1981; Ward、 1981; Roth、1985; Robart & Ward、1990)。GFP の蛍光は、ポリアクリルアミドゲルや 1% SDS ポリアクリルアミドゲル上でナノグラム単位のタンパク量で分離した場合でもある程 度 認 め ら れ ま す ( I n o u y e & T s u j i 、 1 9 9 4 a )。 高温や極端な pH あるいは塩化グアニジウムなどで GFP を変性させると、蛍光は失われます が、タンパク質を復元すると部分的に蛍光を回復できます(Bokman & Ward、1981; Ward & Bokman、1982)。タンパク質を蛍光型に復元するために、チオール化合物が必要な場合があ ります(Surpin & Ward、1989)。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.2818-7 - 2010/07/02 (金) 11:51:29 - GFP 皆様、アドバイス有難うございます。 実はかなり細かい経緯をはしょっていました。 元々、トランスフェクションのコントロールにルシフェラーゼを入れてYFPレポーターと一緒に測ろうとしていました。なので、luciferase assay kitのLysisバッファーを使って壊そうとしていました。しかし、それで上手くいかなかったため、まずはトランスフェクション無しで細胞の溶解の条件だけを検討していました。 また、YFPのレポーターに半減期を短くするためにPEST配列を入れています。そのため、できるだけ短時間で溶解、測定に持っていきたいと考えています。トリプシン処理だと時間がかかると思って、Lysisバッファーで溶かしてすぐ、測定しようと思っていました。 私も１％NP-40ならわりとマイルドに核膜も含めて細胞を壊せると思ったのですが、少なくとも私の細胞ではLysateがどろどろせず、カスみないなのが残ったので、顕微鏡でみたところ細胞より一回り小さい小胞が残っていました。それが核かどうか確認はしていませんが。 もう一回今度はトランスフェクションして、RIPAでやってみればいいのですが、取るのが少し面倒なPrimary cultureを使っているので、もしどなたかGFP、YFPの界面活性剤耐性についてご存知の方がいらっしゃればと思い、質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.2818-6 - 2010/07/02 (金) 11:42:06 - q せっかくGFPなのですから、96ウエルフォーマットのフルオロメーターがあれば、破砕がいらないし、とても簡単だと思いますけれど。。。。

(無題) 削除/引用 No.2818-5 - 2010/07/02 (金) 10:57:21 - ats 細胞をトリプシンで剥がして、溶解せずにそのまま測定ではダメなの？

(無題) 削除/引用 No.2818-4 - 2010/07/02 (金) 10:03:35 - in situ 1% NP-40であれば核膜は壊れると思います。 ただ、核の構造自体は保たれているので、EGFPやYFPを何らかの可溶性の低い（クロマチンや細胞骨格に強く結合する）タンパク質と融合させていたりすると、可溶化されてこないと思います。 RIPAで可溶化後にEGFPやYFPの蛍光が保たれているかどうかはassayしたことがないので分かりませんが、多分大丈夫なのでは。

(無題) 削除/引用 No.2818-3 - 2010/07/02 (金) 08:59:04 - ats ルミノメーターでは蛍光は測れませんけど。フルオロメーター機能が付いていますよね。

(無題) 削除/引用 No.2818-2 - 2010/07/02 (金) 08:05:13 - take_ で？ ルミのメーターで測ってみたのですか？ そういう実験はやったことないので、いい加減な意見になるかもしれませんが、そこまで調製したならば、測ってみれば分かることでは？

GFP, YFPの安定性 削除/引用 No.2818-1 - 2010/07/02 (金) 07:29:02 - GFP どなたかEGFP、YFP(Venus)の界面活性剤に対する安定性についてご存知の方がいらっしゃいましたら、教えていただけませんでしょうか。 現在、EGFP、YFP(Venus)を用いたレポーターアッセイをやろうとしています。トランスフェクトした培養細胞をlyseしてからルミノメーターで蛍光を測ろうと考えています。 プレ実験で細胞をluciferase assay kitについているバッファー(組成不明）で溶解しようとしたのですがディッシュにくっついたままでちゃんと壊れませんでした。1% NP-40を含むバッファーでは核が残ったままでした。YFPにNLSがついているのでできればちゃんと核も壊れてほしいと思って、RIPAバッファー（1% NP-40, 0.5% Sodium deoxychorate, 0.1% SDS)を試したところ、ちゃんと融けてどろどろになったのですが、この条件で蛍光がちゃんと保たれているか心配です。 よろしくお願いします。

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