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(無題) 削除/引用 No.2817-5 - 2010/07/02 (金) 12:18:43 - CoIP お返事どうもありがとうございます。 APさんが仰るように、何となく二次抗体の問題ではないかという気がしてきました。試してみようと思います。 メンブレンを切ったのは異なる分子量のタンパク質をそれぞれの抗体で検出するためです。 免沈のネガコンについては論文でもIgGを使ったり、pre-immuneを使ったり、色々ですね。私の抗体はアフィニティー精製してありますので、厳密にはpre-immuneがネガコンにはならないかもしれません。また、IgGだけを含むわけでもないのでIgGを使うのも正確ではないですね。IPの完全なネガコンとなると、同じ抗体溶液で目的のタンパク質に対する抗体だけを除いたもの、ということになるのでしょうか。それは現実的ではない気がするのですが、どのようなネガコンをとっていらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.2817-3 - 2010/07/02 (金) 09:37:26 - AP まず一次抗体をスキップして二次抗体のみ検出する対照実験をやってみては。 予想では、それでも同じ結果になりそうな。 対照実験として免疫前血清を使っているとのことですが、IPに使っているのは抗血清ですか？　であれば、アフィニティー精製してから使えば解決できるかもしれません。すでに精製済みなら、免疫前血清で対照をとるのはスジが違います。

(無題) 削除/引用 No.2817-2 - 2010/07/02 (金) 08:16:08 - take_ 「メンブレンを切る」 どの位置で切ったのかわかりません。 何のために切ったのか分かりません。 「100kDa」 A抗体を電気泳動し、B抗体や70kDa 抗体で検出操作をしたら？ あるいは、下記参照。 「ネガコン」 何に対するどういう対象区なのかを整理することをお勧めします。 本番実験から１因子を抜かしたものは、ネガコンです。 沈のステップなら、pre-immune もそうですが、 ・抗体を抜く ・細胞ライセートを抜く ・ビーズを抜く、なども。

免疫沈降のバックグラウンド、IgG? 削除/引用 No.2817-1 - 2010/07/02 (金) 05:57:02 - CoIP 免疫沈降について教えていただきたく投稿させていただきました。 タンパク質Aを免疫沈降で落とし、B（約100kDa）が共沈するかどうかをウェスタンで確認しようとしています。抗A抗体、抗B抗体、共にラビットです。ネガコンにはpre-immune血清の免沈をしています。最初にやった時には、インプットと抗A抗体の免沈でのみBのバンドが出たのでくっついていると判断しました。 しかし、実はこの時は他にも幾つかのタンパク質の結合を見たかったのでメンブレンを切って同時に異なる抗体でプローブしていました。そこで、念のため、特異性を確認するため、同じサンプルを使って、メンブレンを切らずにプロービングしてみたところ、何となくBのバンドが免沈のレーンでスメア気味になりシグナルも弱くなりました。さらに、困ったことに70kDaのタンパクを検出する別の抗体（ラビット）でも、抗A抗体の免沈のレーンに同じようなバンドが100kDa付近にでてしまいました。もしかしたら、たまたま抗A抗体の量がpre-immuneより多く、免沈に使った抗体の何かが同じラビットの抗体でウェスタンで検出されてしまったのではないかと懸念しています。免沈とウェスタンに同じ種の抗体を使った場合は普通はIgGの５５ｋDa、２５ｋDaがでてくると思うのですが１００ｋDa付近にも何か出ることはありえるでしょうか。ちなみに、メンブレンを切らなかった時は、５５ｋDa、２５ｋDaには非常に強いシグナルが出ていましたが、１００ｋDaのはそれに比べるとはるかに弱いです。 ややこしくて申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

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