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RIプローブno精製 トピック削除
No.2814-TOPIC - 2010/07/01 (木) 19:33:38 - 32P
ゲノムサザンを行うために、RIでラベルしたDNAプローブ（500bp位）を精製しようと考えています。
そこで、精製に使うキットに関する質問です。
メーカーが指定するキットでなくともプローブの精製はできますでしょうか？
例えば、普段PCR産物を精製するときに使うキットなどでも大丈夫でしょうか？

さらに、お聞きしたいのですが。
プローブの精製をしなかった場合には、やはり、バックが高くなるのでしょうか？

経験豊富な方のご意見をお聞かせください。
　
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No.2814-5 - 2010/07/01 (木) 21:32:53 - take_
そんなの周りに居る人に見てもらえばいいじゃん。
という時代でなくなってきていますネ。
ぼくのところも、ついにX線フィルム現像機を捨てようかどうしようかという議論をしています。ウェスタンも、アナライザーで発光を検出するようになったし。

ぼくはずーーーーっとベーリンガー(Roche) のランダムプライムラベルキットをdCTP でラベルして、ファルマシアのG50充填済みのNICK カラムでぽたぽた自由落下で精製しています。
ロードして250 ul ずつ分画して、何本目が使えるか、っていうのはほとんどぶれませんので、ぽたぽたがじれったいですが、使い続けています。
分画のカウントをそれぞれとれば、ラベルの入り具合もわかるし。
古臭いですが、同じ条件でやり続けるのは安心できます。

ついでに、トランスファーはHybond-N+ のアルカリ法、アマシャムのラピッドハイブリダイゼーションバッファーでブロッキングは自前で作ったサーモンスパームDNA です。（主にヒトとマウスです）
洗いは自前のSSC + SDS で、古典的な教科書どおりです。

余計なお世話だけど、プローブは、ハイブリバッファによく懸濁してからメンブレンに触れさせるように。

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No.2814-4 - 2010/07/01 (木) 20:49:39 - AP
端的にいうと、そういうことです。

シリカタイプのやつでは、液漏れは頻繁に経験しますし、なんども液を加える必要があり手数が多い→事故のリスクが高いですから、、、

ゲノムサザンくらいならnon-RIでできてしまうようになっているので、RIプローブは10年以上使っていない、、、、、

(無題) 削除/引用
No.2814-3 - 2010/07/01 (木) 20:41:10 - 32P
AP様、ありがとうございます。

メーカーとはRocheのことです。
RocheのHPによると、PCR産物の精製には「ハイピュア PCR産物 精製 キット（グラスファイバーフリースタイプだそうです） 」を、RIラベルDNAには「クイックスピンカラム 」を薦めています。

精製度はどちらも変わらないかもしれないが、汚染の可能性が少ないゲル濾過が最適であるという理解でよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2814-2 - 2010/07/01 (木) 20:10:42 - AP
メーカが指定するキットとは何で、普段PCR産物を精製しているキットというのは何でしょう。それがわからなければ判断付きません。

一般的にはRIプローブの精製にはゲル濾過が最適です。プレパックスピンカラムの市販品もありますし、単品で購入したセファロースG-50やG-25をボウジュンさせて、1-mLのツベルクリンシリンジにつめてスピンカラムを自作するというのも昔からよく行われています（たぶんMolecular Cloningなどに載っています）。

PCR精製に使っているキットというのが、シリカマトリックスタイプのスピンカラムだとすると、精製は不可能ではないけれど、ウォッシュでホットな廃液が増えるのと、器具からの漏れ（隙間にしみこみやすいアルコールを含んでいますし）やエアロゾルによる汚染の心配があります。

ならばむしろエタノール沈澱（フリーのヌクレオチドを沈殿させないためには塩としてNH4OAcを使うと良いとされています）のほうが安全でしょう。

精製しないとバックがあがる可能性はあります。シグナルが強くて短時間のexposureでいいような場合はそれでもいい場合もありますが、微弱なシグナルだと、バックグラウンドを少しでも下げないと十分なS/Nが得られないでしょう。

それともうひとつ、プローブに取り込まれるRIはホンの一部です。精製しないとフリーのRIによる非常に高い放射活性があるわけで、それをハイブリやらウォッシュやらで扱うのは、不必要な被爆や汚染の可能性を高めますし、高放射活性の廃液を大量に出すことになるので賢くないです。

RIプローブno精製 削除/引用
No.2814-1 - 2010/07/01 (木) 19:33:38 - 32P
ゲノムサザンを行うために、RIでラベルしたDNAプローブ（500bp位）を精製しようと考えています。
そこで、精製に使うキットに関する質問です。
メーカーが指定するキットでなくともプローブの精製はできますでしょうか？
例えば、普段PCR産物を精製するときに使うキットなどでも大丈夫でしょうか？

さらに、お聞きしたいのですが。
プローブの精製をしなかった場合には、やはり、バックが高くなるのでしょうか？

経験豊富な方のご意見をお聞かせください。
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