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(無題) 削除/引用 No.2808-15 - 2010/07/01 (木) 18:34:45 - あず ありがとうございます。 pENTR Directional TOPO Cloning Kitを使用していまして、 このキットにはM13 primerも供給されています。 ご指摘の通り、配列は短いです・・・。 ＞インサートのプライマーとM13 のPCR は？（No.2808-2） このPCRはかからないです。 インサート側からシーケンスを読んでみます。 何か進展がありましたら、報告させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.2808-13 - 2010/07/01 (木) 17:35:20 - ザンギ APさん、フォローありがとうございます。 98℃で5分って激しい変性条件ですね。 昔のマニュアルにのってたのはこんな条件だったかなぁ．．． アニーリングの省略もするみたいだし、古典的なM13プライマーは短いので このベクターでは読みにくいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2808-12 - 2010/07/01 (木) 00:33:59 - AP あー、これですね。 http://www.invitrogen.jp/gateway/pdf/penter_seq.pdf 高度な二次構造のために数百bpのインサートのシークエンスが困難なことがあり、サーマルサイクルの改変法が示されていますね。 またマニュアルには、インサートをPCRで確認するときは、M13 (or M13 reverse)とインサート特異的なプライマーとの組み合わせで行うようにとなっていますね。

(無題) 削除/引用 No.2808-11 - 2010/07/01 (木) 00:09:59 - ザンギ ひとつ思い出しました。 そのベクターでは、シーケンスプライマーのどちらか片方はうまく働かなっ た記憶があります。 ベクターの製品添付マニュアルの後ろのほうにシーケンス反応の改変法が 載ってたと思いますが、試しましたか？ プライマーサイトがほんとに潰れてるんならメーカーに文句言ってください。

(無題) 削除/引用 No.2808-10 - 2010/06/30 (水) 22:20:08 - take_ 「その」M13 プライマーと、 「その」ベクターのM13 配列は一致していますか？ 「キット」はベクター用のキットですか？ シーケンス用のキットですか？ M13 プライマーと一言で片付けて居られますが、 ザンギさんがおっしゃるように、いろんなバージョンが有ります。 張り付く配列が何ベースか違うとか、同じ位置でも配列が違うとか。 インサートのプライマーとM13 のPCR は？（No.2808-2）

(無題) 削除/引用 No.2808-9 - 2010/06/30 (水) 21:28:14 - あず ありがとうございます。 M13 primer siteがつぶれることは通常考えられないのですが、それが起こっているようで困っています。

(無題) 削除/引用 No.2808-8 - 2010/06/30 (水) 21:12:07 - ザンギ シーケンスが読めないのが問題なんですか？ 最初の記事にはそうは書かれてませんね。 件の繰り返し配列の内側にシーケンスプライマーを設定してやれば読めます。 ただ、インサートに近くて配列は読みにくいと思います。 インサート部分から外側に向けたプライマーを設定してやればいいのでは？ ダイプライマーしか使えないシーケンサなら問題ですが。

(無題) 削除/引用 No.2808-7 - 2010/06/30 (水) 21:07:24 - あず 御意見ありがとうございます。 M13プライマーはキットに附属されているものを使っています。 transformation後、プレートに播く前に大腸菌をペレットにして、ligation反応液の持ち込みを減らしています。また、コロニーの生えていないアガロースをつついたものもコントロールにおき、PCRがかからないことも確認しています。 プラスミドを取って制限酵素で切断後、プラスミドの大きさから空ベクターではなく、インサートを含む大きさに間違いないのです。でも、M13のサイトがないのか、シークエンスがかかりません。インサート側から読めばいいのでしょうが、それでは解決にはならないので、何かアドバイスを頂けたらと思っています。宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2808-6 - 2010/06/30 (水) 21:06:40 - ザンギ 検索すべき過去ログの内容についてはAPさんが書いてくれました。 コロニーPCR擁護派ではないですが、 昔は　DNAを増やすのは大腸菌の中で　っていうのが大前提だった気がします。 今は　DNA増幅はサーマルサイクラーで　が第一選択なんでしょうか。 どちらも一長一短があると思うので、うまく使い分ければいいと思います。 O/Nカルチャーしてる間に、コロニーPCRでインサートを確認して、PCR産物を精製 してシーケンサで配列を読んでおくような事は以前やってました。

(無題) 削除/引用 No.2808-5 - 2010/06/30 (水) 20:55:19 - take_ PCR でなく、昔ながらの方法でプラスミドを調製して制限酵素処理して、期待通りのバンドが泳動でみえるの？

(無題) 削除/引用 No.2808-4 - 2010/06/30 (水) 20:53:18 - AP 過去ログといえば、コロニーPCR懐疑派で、プラスミドを精製してスクリーニングするのを第一選択とする人もいます（私もその一人）。 まあ、キットで精製する方法しかやったこと無い、それしかできない人たちは面倒くさい、コストがかかると敬遠するかもしれませんが、これほど簡単で金のかからない手技もほかにないくらいです。

(無題) 削除/引用 No.2808-3 - 2010/06/30 (水) 20:45:30 - AP >一方で、インサート内部のプライマーでPCRをかけるとほぼ100％の効率で増幅されます。 ためしにコロニーの生えていないところをつついて同じようにPCRをかけて御覧なさい。それでもほぼ100%増幅が見られるでしょう。 大腸菌と一緒に目的のDNA断片を含むligation反応液もプレート上に塗りたくられているので当然と言えましょう。 単純に組換え体が得られていないというだけのように思います。

(無題) 削除/引用 No.2808-2 - 2010/06/30 (水) 20:40:12 - ザンギ 同じようなことを経験したことがあります。 記憶があやしいですが、思い出せることをいくつか。 ・pENTRはクローニングサイトの両側に繰り返し配列があるので、普通のPCRが かかりにくいようです。 ・M13プライマーは同じような名前のものでも、微妙に配列が違います。 メーカー推奨のものでなければ、配列の確認が必要です。 ・TOPOベクターの自作は出来ないと思うので、ベクターのM13プライマーサイトがつぶれる可能性はあまりありません。 ・ベクター部分のプライマーとインサート部分のプライマーでPCRをかけてみて ください。 インサート部分のプライマー同士では、コロニーじゃないところでもPCRがかか りそうです。詳細は過去ログを検索してください。

pENTR/D-TOPOのトラブル 削除/引用 No.2808-1 - 2010/06/30 (水) 20:15:04 - あず 植物由来の550bp, 850bpの遺伝子を pENTR/D-TOPOベクターにクローニングしています。 添付されているプロトコールに従い、pENTR/D-TOPOベクターにクローニングの後、コロニーは普通に生えてくるのですが、生えてきたコロニーをベクタープライマー（M13）でPCRをかけると全く増幅されません。一方で、インサート内部のプライマーでPCRをかけるとほぼ100％の効率で増幅されます。インサートの挿入は効率良く起こっているのに、M13プライマーサイトを含む配列が潰れているようです。 このような経験をされた方はいますか？ 何かアドバイスを頂けると幸いです。

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