いつもお世話になっております。
新しく着任したラボにてbeta-galactosidaseのプラスミドの増幅を行っています。
大腸菌DH-5aもしくはMach1にトランスフォーメーションし、単独コロニーをピックアップ、100mlのLB培地に100ulのアンピシリンを加え、overnightでcultureし、Qiagenのmidiprep、と通常の手順で行っています。しかし、コロニーは生えるし、大腸菌は増えるのですが、プラスミドの収量が極端に少ないのです。せいぜい数マイクログラムしか取れていません。同時に行った他のプラスミドのmidiprepでは100マイクログラム以上とれているので、方法自体は間違えていないと思っています。overgrowthを疑い、短めの時間でのcultureにもtryしたのですが、それでも取れませんでした。大腸菌の株を変え、LB以外にも2xYT培地を試し、smart ampicillingを使う、抗生剤を少し増やすなどいろいろと工夫しているのですが、それでも取れません。後はcultureの温度を下げるぐらいしか思いつかない状況です。何かよい方法がありましたらご教授頂けますと幸いです。 |
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