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(無題) 削除/引用 No.2806-11 - 2010/07/05 (月) 16:42:27 - mom-a ＞そもそも酵素処理の時間も、37℃で15~30分以上かけているものもあり、「できる限りスピーディに、冷たい環境で」というRNA抽出の原則からはかけ離れていますし いや、RNA抽出は元気な細胞を採取してから後の話ですから、細胞採取のステップは冷たくなくてもスピーディでなくても細胞が元気に取れてくれば問題ないでしょう。とはいっても、確かに酵素処理が長すぎると細胞がダメージを受けてしまいますが。 real time PCRで発現がみたいなどであれば、TRIZOL処理ではなく、細胞数が少なくても検出できるキットを使う、という手もあると思います。そうすれば、細胞数が少なくても良いので酵素処理を短くできるかもしれません。（ただし、剥がれやすい細胞が集まる、というバイアスがかかるかもしれません。） emaさん、ヤマダさんは血管ごと処理してからソーティングされているようですが、RNAは得られているようですから、必ずしも酵素処理がいけないわけではなく、条件次第なのではと思いますが…。

(無題) 削除/引用 No.2806-10 - 2010/07/02 (金) 08:27:26 - take_ 培養を経ても経なくても、の前に、 「なぜRNA が採りたいのでしょうか？」 PCR による物取りなら、血管丸ごとでもできるけど、 発現量を調べる（内部コントロールと比較など）だと、 細胞を分画するのは必要／不要の検討が必須だし、 その次の検討ステップとして、培養は「別の細胞に なる恐れがあるのでご法度(No.2806-7 mom-aさん）」 なのかどうか。 分画必要、培養ダメ、なら、どうやって採取する 細胞数を確保するのか。＜この時点で、この板が 役に立ちます。 RNA とりの前に、その辺を身内でよく話し合うこと をおすすめします。

内皮分離していました 削除/引用 No.2806-9 - 2010/07/02 (金) 00:54:42 - ヤマダ ラットの大動脈から内皮を分離をしていました。 37C,10minのコラゲナーゼ処理後に、CD31抗体を結合したbeadsで 内皮とそれ以外の細胞にわけてました。 3-4cmの大動脈を処理し、分離前、分離後の内皮細胞、内皮以外の細胞の 三つそれぞれで1ug前後(10ng/ul程度, 260/280=1.8前後)のtotal RNAを 回収出来ていました。 電気泳動では確認してませんでしたが、PCRするには充分な量がとれ、 内皮マーカー gene、endogenous controlもきちんと増えていたので、 こんなものかなと納得していました。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2806-8 - 2010/07/02 (金) 00:14:46 - ぷーさん mom-a様 おっしゃるとおり、培養すると生体内での遺伝子発現とはかなり異なるのではないかと思い、培養を経ずにRNA抽出をと考えています。 ただ、色々な文献や、他の方々のコメントをみていると、どうやら培養を経ている方が大半のようで、わざわざ培養を経ているのは、やはり回収できるRNAの量が少ないからかな、と思い始めました。そもそも酵素処理の時間も、37℃で15~30分以上かけているものもあり、「できる限りスピーディに、冷たい環境で」というRNA抽出の原則からはかけ離れていますし、直接RNAを抽出するというこは念頭にないのかもしれないですね。 ＞OD値は2.2~2.3で、取れている核酸の量は0.5ugくらいです。 すみません、「OD値」というのは260nm/280nm比のことでした。端折り過ぎですね。これまでの経験上、この値が2.2以上だとRNAが分解していることが多かったことと、18S, 28Sのバンドが見えなかったのでそう判断しました。電気泳動は、毎回positive contorolをおいて手技的に問題ないことを確認しています。 RNAをとりたいなら、そもそも組織採取法から変えなければいけないかもしれませんね。。

(無題) 削除/引用 No.2806-7 - 2010/07/01 (木) 14:03:04 - mom-a 血管内皮細胞だけが欲しいのですよね。 培養することのメリットは増やすことができるので、それこそRNAを抽出するのなら、細胞が多い方が簡単にできるでしょう。デメリットは生体内とは様々な状況が変わってしまうこと。培養系にもっていくことによって観たい現象が観れなくなってしまう可能性があります。ここが大丈夫という確信があれば、細胞を増やしてからRNA抽出、というのもテかもしれませんが。 培養できないとなると、酵素法で剥離してきてどの程度の細胞がとれているかということですが…たくさん細胞を取ろうと思ってトリプシン処理を長くしても、トリプシンのダメージもあるので、RNA回収量は減ってしまったり、degradationしてしまったりするかもしれません。 ＞OD値は2.2~2.3で、取れている核酸の量は0.5ugくらいです。 吸光度から量を計算しているのですよね？？「OD値」とおっしゃっているのは260nm/280nm比のことではないですか？だから2.0を超えているので「高すぎる」とおっしゃっているのでは？もともとの吸光度はいくつでしたか？値が小さければ（分母が小さいですから）誤差が出て2.0を超えることはあります。 大動脈3-4cm分の内皮細胞のRNAから0.5ugとれているなら、「少ない」ということはないと思いますが…。電気泳動の方に問題があるからバンドが見えない、という可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.2806-6 - 2010/07/01 (木) 08:13:07 - take_ 3 mm 角。 血管でなく色々な組織です。血管だけというのは、やったことがありません。 培養。 細胞を分離ということでしたので、初代培養を経ているのかと勘違いしました。 黄色い。 クロロホルムを入れた後の下の液の色です。 原理的にはアシドフェノール acid phenol 法で、フェノール側にDNA、水相にRNA になっています。pH がアルカリ側によっていくと、DNA は水相に来てしまいます。 あぶら。 組織クラッシュとIsogen (Trizol) を混合し、クロロホルムを加える前に遠心して、あぶら、ピンク色、組織残さに分け、ピンク色を新しいチューブに入れてクロロホルムを加えると、きれいになる気がします。実際そのようにしてます。 ついでに、水相はイソプロを入れる前に、もう一度クロロホルムを入れて抽出しています。 Isogen。 ぼくはTrizol を使っていますが、目の前のプロトコールのコピーはIsogen のカタログページです。流れ図で書いてあるので、使っています。 内皮細胞。 血管そのままではダメなのですか？ RNA 取りは、Isogen (Trizol) を混合するまでの時間をいかに短くするか、それまでの手順をいかに少なくするか、それと低温を保つかです。敵のRNase は酵素ですから、制御ポイントは時間と温度というわけです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2806-5 - 2010/06/30 (水) 22:05:46 - ぷーさん take_様 培養はしていません。培養ではなく、とってきた細胞からそのままRNAを抽出しています。「思想　培養を経る（直接でない）意味はなぜですか？」というのは、私が培養を経ないことへの問いでしょうか？逆に、培養を経ている方々に、そのメリット・デメリットをお聞きしたいのですが、、、 抽出はISOGENです。血管は厚さは3mmもないですけど、3mm四方の血管壁で十分なRNAが取れるのですか、、、ちょっと一から見直さないといけないようです。 それから、抽出して3層に分かれた上層が黄色いのは、グリコーゲンが多いからかな、と思っていました。以前肝臓からRNAをとったときにかなり黄色かったので。組織が多かったのかもしれませんね。不勉強で申し訳ないのですが、Trizolが元組織に比べて少ない場合にDNAが混入してしまうのはなぜですか？ ema様 お恥ずかしながら、細胞数は数えておりません。組織をとってきて内皮細胞を分離した液を顕微鏡で見ても、細胞らしきものはあるかどうか、というレベルです。OD値は2.2~2.3で、取れている核酸の量は0.5ugくらいです。

(無題) 削除/引用 No.2806-4 - 2010/06/30 (水) 21:14:07 - take_ Trizol でDNA のコンタミが疑われるとり方の場合、Trizol が元組織に比べて少ないかもしれない。 ピンク色が黄色っぽいなら、Trizol 少なすぎです。経験上。

細胞量は？ 削除/引用 No.2806-3 - 2010/06/30 (水) 10:59:24 - ema 酵素法で細胞を分離しているとして、細胞数は（約でよいので）どれくらいでしょうか？ 酵素処理中に細胞障害があってRNA量としてとれない事もあります。 こちらではマウスで分離染色ソートして１０＿５単位細胞でTrizol＋カラムで回収してすくないとはいえng単位回収でき、Agilent2100（pico)で泳動して品質チェックまでできています。 ＞OD値は高すぎる は、分解以外にDNAのコンタミでもありますのでしっかりDNAseをかけます。ただ ＞吸光度計での濃度としてもかなり低く＋＞OD値は高すぎる は？？？な表現でOD上で数値があるのか無いのかはっきりしません。

(無題) 削除/引用 No.2806-2 - 2010/06/30 (水) 08:22:50 - take_ 技法 培養スケールはどのくらいですか？ 培養できてますか？増えないにしても細胞は生きていますか？ 最終的にどのくらいの溶媒に溶かしていますか？ どのような抽出手技を用いていますか？ 泳動のゲル・バッファ組成は？ バンドは見えなくても、壊れたものが大きい移動度でたまっている感じですか？ 思想 培養を経る（直接でない）意味はなぜですか？ ＃ ウサギのいろんな組織からRNA を取ったことがあります。 組織分離後、すぐに液体窒素凍結します。 後のことが有るので、3mm 角ぐらいのサイコロにしておきます。 抽出はInvitrogen のTorizol でやっています。 組織50 ul 位に1 ml です。 20-50 ul の水に溶かして、0.5-1.0 ug/ul 位にはなっています。

ラットの大動脈内皮細胞のRNA抽出 削除/引用 No.2806-1 - 2010/06/30 (水) 00:25:14 - ぷーさん 現在、ラットの大動脈から内皮細胞を分離してRNAを抽出することを考えています。内皮細胞は酵素法でとっています。大動脈3-4cm分の内皮細胞のRNAを抽出しているのですが、吸光度計での濃度としてもかなり低く、電気泳動ではバンドが見えません（OD値は高すぎるので、degradationかもしれません）。 ここのトピックをみると、内皮細胞の培養については色々議論されているようですが、誰か培養を経ずにそのままRNA抽出している方はいらっしゃいませんか？　または、直接RNAを抽出するのは難しい、などのご意見も、ご存知の方は教えていただければ大変有難いです。

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