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なるほどですね 削除/引用 No.2804-10 - 2010/07/03 (土) 08:21:40 - あき Compatible site同士がくっついた後はどちらの酵素でも切れなくなるとは、なるほど、だから失活させなくてもいいのですね。とても勉強になりました、ありがとうございました。空ベクターをさっそく作製してみます。

(無題) 削除/引用 No.2804-9 - 2010/07/03 (土) 02:13:07 - ザンギ PmeIなら熱をかければ失活するので、この程度の作業ならフェノール抽出 とか、切り出し精製とかはしませんね。 酵素の失活条件なんかはNEBのサイトで調べるのが便利です。 http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0560.asp 余談ですが、 Compatible site同士のSelf ligationなら制限酵素の失活も不要です。 仮に貴方の材料にBamHIとBglIIが1箇所ずつあるとします。 2種類の酵素で切ったDNAの末端同士はLigationしますが、くっついた配列 はどちらの酵素でも切れなくなります。 一方の酵素だけで切れた断片のSelf ligation産物は制限酵素でまた切れて しまうようなので、切れ残りのクローンも非常に少なくなるので知ってお くと便利です。

確認です 削除/引用 No.2804-8 - 2010/07/02 (金) 23:59:47 - あき 確認させてください。 プラスミドからインサートを取り出すさいは、両端にPme1のサイトがあったので、それで切っています。あとは精製後にライゲーション反応を行えば、両端のPme1サイトがSelf-ligationしてEmpty vectorがとれる、ということでよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2804-7 - 2010/07/02 (金) 08:13:44 - ぶん 制限酵素処理した後（フェノクロ・エタ沈は必須ですが） ライゲーション反応を37℃で5分程してcompetent cellにtransformすれば ほとんどがインサートなしのempty vectorになりますよ。

そうでしたか！ 削除/引用 No.2804-6 - 2010/07/02 (金) 07:53:05 - あき 直接トランスフォーメーションしたところ、バックグラウンドのようなコロニーがいくつか生えてきました。きっとこれらをつついてもだめですね。泳動したところ確かに切れ残りは見られないので、たしかに酵素の不活化とライゲーションをすればできそうな気がしてきました。コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2804-5 - 2010/06/30 (水) 14:56:04 - 中年 ご質問を読み誤っていたかもしれません。切り出しは不要ですが、もちろん制限酵素の不活化とライゲーションのステップは必須です。

(無題) 削除/引用 No.2804-4 - 2010/06/30 (水) 14:16:36 - ST ligase処理は省けないのでは。

そうでしたか！ 削除/引用 No.2804-3 - 2010/06/29 (火) 23:24:41 - あき ありがとうございます、さっそくやってみます。結果はまたご報告いたします。

(無題) 削除/引用 No.2804-2 - 2010/06/29 (火) 23:09:55 - 中年 ライゲーション時のDNA濃度やベクターのサイズにも依りますが、ほとんどはインサートの抜けた空ベクターになるでしょう。

Self-ligation 削除/引用 No.2804-1 - 2010/06/29 (火) 22:48:01 - あき プラスミドから制限酵素をインサートを取り出し、Self-ligationでEmpty vectorを作りたいと思っています。そこでご質問なのですが、制限酵素処理した反応液を直接competent cellにtransformし、クローンを取ったら中にはempty vectorも含まれるのでしょうか？素朴な疑問ですが、ゲルからの切り出し精製、ligase処理を省けるのでないかという話題があがりましたので、どなたかご経験のある方いらっしゃいましたら教えてください。

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