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(無題) 削除/引用 No.2800-9 - 2010/06/30 (水) 13:53:09 - 組織 組織２さん、Bostonさん、ありがとうございます。 乾燥時間と、papペンの使用、検討してみます。 dakoペンはtriton使用でも問題なしという意見大変心強いです。

(無題) 削除/引用 No.2800-8 - 2010/06/30 (水) 09:16:23 - Boston PAP PEN は Triton 入りでも問題なく使えています。 Secure-Seal™ hybridization chambers chamber はかなり良いですが、高価です。 ちなみに、Hybri-well Press-seal ハイブリダイゼーションチャンバーはお薦めできません。

(無題) 削除/引用 No.2800-7 - 2010/06/30 (水) 08:57:26 - 組織2 >[Re:5] tauosanさんは書きました : > 　この封入剤→カバーガラス→マニキュアのステップでお勧めの > 　封入剤の乾かし方のコツや技 > 　マニキュア（もしくは接着剤？） > などご教授頂けたらと存じます 固化しない水溶性封入剤を使ってるんですよね？余分な封入剤を除いてやればいいと思います。封入後、キムワイプを2〜3枚重ねたところにスライドガラスをひっくり返してのせ（カバーガラスが下）、スライドの重みを利用して余分な封入剤を吸収させます。そのまま5〜10分くらい放置した後、スライドガラスをそっとひっくり返し（カバーガラスが上）、マニキュアを塗って固定します。封入剤の厚みを減らせるので、観察しやすいという利点もあります。

tauosan 削除/引用 No.2800-6 - 2010/06/30 (水) 08:41:39 - あああ 封入後、O/Nで封入剤をよく乾かして、キシレンでカバーグラスの周りについた余分な封入財をきれいに落としてから、マニュキュアで囲めば大丈夫です。

便乗質問お願いします 削除/引用 No.2800-5 - 2010/06/29 (火) 23:56:52 - tauosan 便乗し恐縮ですが、 　二次抗体のWash終了後 　封入剤（ベクタシールドなど）を一滴たらし、 　カバーガラスを置き、 　周りをマニキュアで囲む という手順を用いているのですが、封入剤とマニキュアがまざり、マニキュアが固まりません。なんとかドライヤを使用して乾かしているのですが、、、 　この封入剤→カバーガラス→マニキュアのステップでお勧めの 　封入剤の乾かし方のコツや技 　マニキュア（もしくは接着剤？） などご教授頂けたらと存じます

(無題) 削除/引用 No.2800-4 - 2010/06/29 (火) 18:54:28 - 組織2 ざっとプロトコールを読む限り、乾燥が不十分なのかなという印象です。 > tritonで剥がれるのですね・・。 > Dakoペンの詳しい組成は分かりませんが、油のようなものということでしょうか。 私も0.3%triton/PBSを使ってますが、剥がれた経験はありません。試しに、以下のようにやってみて下さい。凍結したスライドをフリーザーから出した後、扇風機やドライヤーの冷風で20〜30分乾燥させる。その後Dakoペンを使い、さらに10分ほど風乾する。 あと免疫染色が目的なら、スライドをゆっくり室温に戻す、というのはあまり効果が無いように思います。それよりもしっかり乾燥させて、Dakoペンや切片が剥がれないようにするほうが重要です。 > Dakoペンを使用する場合スライドが濡れているとうまく書けないと思うのですが、親水化させた後乾燥させると非特異が増えると聞いたことがあります。PBS+triton処理後のDakoペン処理はどのように行っているのでしょうか？ パラフィン切片の場合は親水化した後でDakoペンを使いますが、キムワイプなどで組織の周りの水分を良く拭き取ってから、ペンで囲みます。その後、スライドを軽く乾燥させます（1〜2分ほど室温放置）。水分が残っていると、ペンが滲んで組織の上にのってしまうことがあります。それとペンが出過ぎた場合は、少し乾燥してやらないと、PBS中でペンの成分が広がります。 乾燥すると非特異が出るというのは、私は神話の一種だと思っています。抗体液がのっている時に切片を乾燥すれば、抗体が張り付いて非特異になるかもしれませんが、PBSや純水が少し乾いたくらいでは、非特異にはなりません．

(無題) 削除/引用 No.2800-3 - 2010/06/29 (火) 18:23:10 - 組織 ご教示ありがとうございます。 tritonで剥がれるのですね・・。 Dakoペンの詳しい組成は分かりませんが、油のようなものということでしょうか。 triton処理をDakoペン使用前にしてみようと思います。 すみませんが重ねて質問させていただきます。 Dakoペンを使用する場合スライドが濡れているとうまく書けないと思うのですが、親水化させた後乾燥させると非特異が増えると聞いたことがあります。PBS+triton処理後のDakoペン処理はどのように行っているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2800-2 - 2010/06/29 (火) 18:07:54 - よっしー tritonが入っていると剥がれた(浮く)ような記憶があります． 私はtriton処理が必要な場合，ブロッキング後tiriton入りPBSで5分x3回処理し， その後でダコペンで囲っていました． 抗体希釈液からtritonを抜けば大丈夫だと思いますが， 抜けないのですかね．

Dakoペンが剥がれる 削除/引用 No.2800-1 - 2010/06/29 (火) 17:52:03 - 組織 凍結組織切片の免疫蛍光染色を行っています。 染色途中で、Dakoペンが剥がれて抗体が混ざり困っています。 早いものは一染目の一次反応後に既に剥がれています。 このようなことが起こるのは何が原因なのでしょうか？ ご教示いただけると幸いです。 使用試薬とプロトコールは以下の通りです。 固定：アセトン4℃10min 使用スライド：松浪硝子のMASコート、白縁磨 抗体希釈液：2％BSA＋0.2％Triton X/PBS 洗浄液：0.1%BSA in PBS ブロッキングバッファー：dakoのProtein Block Serum Free 薄切後、風乾、アセトン固定、風乾。 ↓ -20度で一か月ほど保存 ↓ ゆっくりと室温まで戻し、dakoペンでサークルをかく ↓ 室温でdakoペンを乾燥 ↓ PBSで5min親水化 ↓ ブロッキング10min ↓ 一染目、一次抗体4℃、overnight ↓ 洗浄 ↓ 二次抗体、RT30min ↓ 洗浄後、二染目（ブロッキングから繰り返し）

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