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(無題) 削除/引用 No.2797-12 - 2010/07/04 (日) 15:42:28 - 中年 私もAPさんと同様に２種類のプラスミドを作製しようとしているのだと解釈しましたが、No.2797-9を読んで訳が分からなくなりました。 「ベクター」はあくまで空のベクターを指す言葉なので、タイトルの「大型ベクターの作製」は、インサートを含んだプラスミドの作製のつもりならば不適切です。この用語の混乱は訳がわからなっている一因です。 > コロニーPCRの他にミニプレップでベクターを取得後、制限酵素処理でバンドパターンの解析も行いました。 これはベクターではなく、プラスミドの取得ですね。 > その結果、AとBそれぞれ２種類のベクターが１つの大腸菌に混在する形となっている模様です。 よく分からないのですが、制限酵素処理しないでそのまま泳動したら、２種類のプラスミドに相当するバンドが見えるのですか？そうでないなら、２種類のプラスミドの混在ではなくて、おかしなライゲーション産物が出来ているだけだと思われます。 > 自分の案では、Aからインサートを切り出し、Bのベクターのみ（インサートを含まない）にライゲーションし、Aインサート・Bベクターというコンストラクトを作製後、Aインサートを切り出し、Bとライゲーションさせれば良いのでは無いかなと思っております。 意味が分からないのでこれに対するコメントは差し控えます。

(無題) 削除/引用 No.2797-11 - 2010/07/03 (土) 20:21:07 - AP >自分の案では、Aからインサートを切り出し、Bのベクターのみ（インサートを含まない）にライゲーションし、Aインサート・Bベクターというコンストラクトを作製後、Aインサートを切り出し、Bとライゲーションさせれば良いのでは無いかなと思っております。 わかりにくくてすいません。 本当にわかりにくいですよ。 >現在、Ａ(インサート11kb, ベクター3kb)、B(インサート15kb, ベクター4.5kb)のライゲーションに苦戦しております。 と書いていたから、3-kbベクターに11-kbインサートを入れたコンストラクトAと4.5-kbベクターに15-kbインサートを入れたコンストラクトBを作成しようとしているのだと思っていましたが、ちがうのですか。そんなふうに理解するのは私だけ？ で、最終的にはどんな構造にしようとしているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2797-10 - 2010/07/03 (土) 20:01:48 - ザンギ 異なるoriを持つプラスミドは大腸菌1匹の中で共存できますが。 oriとは複製開始領域のことで、厳密にその塩基配列でタイプが決まっています。 pBR系のoriと共存できるベクターも市販されていますが、低コピー数で使い にくいので殆ど出回っていないはずです。 このログを何回か読みなおしたんですが、何を作りたいのか見えてきませんでした。 プラスミドAのインサート部分11kbp；Ains プラスミドAのベクター部分3kbp；Avec プラスミドBのインサート部分15kbp；Bins プラスミドBのベクター部分4.5kbp；Bvec で最終産物を書いてもらえませんか？ 最後の書き込みだとBvec+Bins+Ainsですか？ それとAvecとBvecの選択薬剤は何ですか？

(無題) 削除/引用 No.2797-9 - 2010/07/03 (土) 18:39:48 - K 中年さま コロニーPCRの他にミニプレップでベクターを取得後、制限酵素処理でバンドパターンの解析も行いました。その結果、AとBそれぞれ２種類のベクターが１つの大腸菌に混在する形となっている模様です。 originが異なるベクターは一つの大腸菌に２種類のベクターを持たせることが出来る話を聞いたことがあります。このケースでしょうか？ また、この回避策をどなたかご存じでしたらご教授願えますと幸いです。 自分の案では、Aからインサートを切り出し、Bのベクターのみ（インサートを含まない）にライゲーションし、Aインサート・Bベクターというコンストラクトを作製後、Aインサートを切り出し、Bとライゲーションさせれば良いのでは無いかなと思っております。 わかりにくくてすいません。

(無題) 削除/引用 No.2797-8 - 2010/07/03 (土) 15:04:50 - 中年 コロニーPCRではなくて、数コロニーに対してミニプレップでDNAを取り、取れてきたプラスミドがどのような形をしているかを確認すると問題の所在がはっきりするかと思います。 > 1:5.5、1:4.5、この程度の比率でしょうか？それとも1:50,1:0.5の程度でしょうか？ その両者の間くらいが適切でしょう。

皆様ありがとうございます 削除/引用 No.2797-7 - 2010/07/03 (土) 14:59:23 - K 回答ありがとうございます。 pumpkinさま ゲルは一部を染色して、大部分を未染色で切り出し、エチブロとUVのストレスを除いてあります。 ライゲーション時のモル比を細かくとはどの程度でしょうか？ 現在ベクター：インサート＝1:5でやっております。 1:5.5、1:4.5、この程度の比率でしょうか？それとも1:50,1:0.5の程度でしょうか？ まうすさま ベクターが壊れているわけでは無いように思えます。 １コロニーに対して、ベクター・インサートそれぞれの一部をPCRチェックをするとそれぞれのバンドターンは得られますが、１コロニーにベクター・インサート（インサート＋元ベクター）が入っている状態で、ライゲーションされた形のものは得られておりません。 APさま おっしゃるとおりでございます。 現在はケミカルコンピテントセルだけでなく、エレクトロポレーションも試していますが成功はしていません。そのため、ライゲーションを疑った次第であります。

(無題) 削除/引用 No.2797-6 - 2010/06/30 (水) 14:59:51 - Pumpkin APさん いえいえ、お気になさらずにw

(無題) 削除/引用 No.2797-5 - 2010/06/30 (水) 14:47:41 - AP 前の書き込み、Pumpkinさんの敬称が抜けていましたね。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.2797-4 - 2010/06/30 (水) 09:30:46 - AP 「ligationに苦戦」といっても、ligation自体がうまくいっていないのではなくて、形質転換体が生えてこないということではないですか？ Pumpkinがおっしゃるように、長い断片ほどUVの影響が現れやすいです。 たとえばあるUV照射条件でピリミジンダイマーが平均3 kbに一個生じるとすると、2 kbの断片だと確率的に3分子に2個のダイマーが生じて、1分子くらいは無傷と期待できます。ところが10 kbの断片だと1分子に平均3個はダイマーが出来ることになるので、よほど運がよい分子でなければ無傷で残らないことになります。 もうひとつ、ベクターサイズが大きくなると格段に大腸菌に入りにくくなります。おおざっぱに言って、数kbのものと比べて10 kbを越えるものでは、一桁は形質転換効率が下がります。electroporationだとサイズの大きいベクターでも高い形質転換効率が得られます（装置はよく普及していますから、自前でなくても近所の研究室のどこかにはあるんじゃないですか）。

30℃培養 削除/引用 No.2797-3 - 2010/06/29 (火) 18:53:03 - まうす うまく行かないのは、Mini-prepしてcut checkしても壊れたベクターしか取れないケースでしょうか？この場合なら、コンピテントセルにトランスフォーメーションする時に、室温１０分でヒートショックをやると大きなベクターは壊れにくくなります。あとはトランスフォーメーション後の大腸菌の培養温度を３０℃にすると大きなベクターは壊れにくくなります。

(無題) 削除/引用 No.2797-2 - 2010/06/29 (火) 17:10:05 - Pumpkin 長距離のインサートの挿入では、ゲル切り出し等のときのUVによるダメージが致命的なため、全くUVを当てないで切り出すといいと思います（私はこれで13kbのインサートクローンを得ることが出来ました)。 あと、ライゲーション時のモル比は結構細かく試してみることをお勧めします。

大型のベクターの作製 削除/引用 No.2797-1 - 2010/06/29 (火) 16:02:33 - K 現在、Ａ(インサート11kb, ベクター3kb)、B(インサート15kb, ベクター4.5kb)のライゲーションに苦戦しております。 大型のベクターの作製経験者の方、ご助言賜れせんでしょうか？

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