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(無題) 削除/引用 No.2796-15 - 2010/07/03 (土) 14:46:00 - 中年 えーと、mRNAじゃなくってcDNAですよね。どうも心配です。

有難うございました 削除/引用 No.2796-14 - 2010/07/03 (土) 13:51:45 - toshi T 皆様のご指摘を参考にして改めて調べましたところInvitrogenで目的のmRNAを含むライブラリーが見つかったのでそちらで作製しようと考えています。 本当にここまでこれたのも皆様のおかげです。 ライブラリーから目的のmRNAの抽出方法がまだまだ勉強不足のため分かりませんが頑張りたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2796-13 - 2010/06/30 (水) 23:08:28 - take_ 公的バンク（事業仕分けで出てたでしょ？） www.brc.riken.jp/lab/dna/ja/ www.nbrc.nite.go.jp/ www.jhsf.or.jp/bank/gene.html www.dna.affrc.go.jp/misc/bank/indexJ.html 企業 Invitrogen Toyobo Open Biosystems

(無題) 削除/引用 No.2796-12 - 2010/06/30 (水) 21:21:15 - take_ ＞目的のタンパク質を発現するようなベクターを ＞購入することができれば良いのですが高いコス ＞トがかかってしまうので・・・そこで遺伝子ク ＞ローニングを考えました。 高いのか高かったのか？ 生物種によるけど、日本の国家プロジェクトの産物とか、手に入る場合がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2796-11 - 2010/06/30 (水) 12:50:50 - 通りがかり > 目的のタンパク質を発現するようなベクターを購入することができれば良いのですが高いコストがかかってしまうので・・・ モノにもよりますが、メジャーな生物種なら cDNA インサートのみのプラスミドを１万円台くらいで購入できるのでは。expression-ready なものだと高くなるでしょうが。 あとはその遺伝子を取ったラボから貰えばタダですよ。

(無題) 削除/引用 No.2796-10 - 2010/06/30 (水) 12:32:21 - AP >目的のタンパク質を発現するようなベクターを購入することができれば良いのですが 材料生物種が明らかにされていないのでもどかしいですが、ベクターを購入できるほどポピュラーな材料であれば核酸配列も既知なのではないですか？だとしたら、アミノ酸配列からの予想なんか必要ないですけれど。

(無題) 削除/引用 No.2796-9 - 2010/06/30 (水) 12:27:39 - 中年 生物種は何なのかを教えていただければ戦略が絞られると思います。

(無題) 削除/引用 No.2796-8 - 2010/06/30 (水) 12:27:11 - AP >目的のタンパク質のアミノ酸配列は既に分かっており、 でしたら、いまの時代ならアミノ酸配列から予想されるDNA配列を導き出して、PCRプライマーをデザインしてPCRで取得するというのが常法でしょう（次点としてプライマーではなくプローブとして、ライブラリーをスクリーニングする）。もちろん、DNA配列は一義的には決まらないので、「degenerate primer」を使います。 近縁種の遺伝子配列がわかっているなら、それを参考にすることでかなり確実性を上げることが出来るでしょう。 いきなりcDNAとか遺伝子全長とかは難しいので、まず短い区間でdegenarate primerを設計しやすいところでゲノムDNA PCRをして、遺伝子の部分配列を得て、そこから正しい配列を解読して、それを足がかりにinverse PCRやPCR walkingする、あるいは得られた部分配列をプローブにライブラリースクリーニングなどなど、 >いえ、この件については自分自身の研究テーマに必要な実験です。 これは失礼しました。ちょっと質問がナイーブすぎると感じたもので。 最近、そのての輩が多く紛れ込んできますし

(無題) 削除/引用 No.2796-7 - 2010/06/30 (水) 12:23:25 - ~ >目的のタンパク質のアミノ酸配列は既に分かっており、その目的のタンパク質(他のタンパク質と一緒に)を発現する細胞というのも分かっています。 その細胞からRNAを抽出しcDNAを合成して、 アミノ酸配列から設計したプライマーでPCRで回収するのが安上がりだと思います。 どのステップで抗体を使いたいのか分かりませんが、全アミノ酸配列が分かっているのであれば、ひとまずタンパク質の回収は目指す必要が無いと思います。 また、貴方が扱っている種によっては、すでにImageCloneなどでクローニングされた遺伝子が販売されているかもしれません。 新しくキットや機器を購入して、人件費を使ってクローニングするよりも、安上がりになるばあいもあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2796-6 - 2010/06/30 (水) 12:12:14 - in situ なんだか若干参考にされている文献が古いような気がします。 確かに、２０年くらい前はゲノム情報もあまり分かっておらず、タンパク質をコードしている遺伝子の塩基配列なども分かっていなかったため、APさまがおっしゃっているようにタンパク質合成中のポリソームを落としてきて…という方法をとらざるを得なかったと思いますが、現在メジャーな生物であればゲノムシーケンスがほぼ分かっています。 ですから、NCBIなどのデータベースで目的のタンパク質のmRNA配列を探してきて、それをもとにプライマー設計、PCRをかけてクローニングという手法が一般的ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2796-5 - 2010/06/30 (水) 11:57:52 - toshi T >>精製できた未知のタンパク質が出発点なら、アミノ酸配列の分析から塩基配列を予想してプローブやPCRプライマーを得るという方法もありますし、抗体を作って発現ライブラリーを抗体をプローブにスクリーニングする手もあります。 未知のタンパク質というわけではなく、目的のタンパク質のアミノ酸配列は既に分かっており、その目的のタンパク質(他のタンパク質と一緒に)を発現する細胞というのも分かっています。やはり、抗体によるスクリーニングする方法が一般的なのでしょうか？ >>もしもですが、、、、宿題か何かでクローニング方法にはどういうものがあるか列挙せよというような課題のための質問でしたら、回答してくれる人たちの仕事のじゃまですので、ご遠慮願います いえ、この件については自分自身の研究テーマに必要な実験です。 目的のタンパク質を発現するようなベクターを購入することができれば良いのですが高いコストがかかってしまうので・・・そこで遺伝子クローニングを考えました。

(無題) 削除/引用 No.2796-4 - 2010/06/29 (火) 16:19:01 - AP 攻め方は非常にたくさんあります。 どの手が使えるかは、手にしている材料・情報によります。 精製できた未知のタンパク質が出発点なら、アミノ酸配列の分析から塩基配列を予想してプローブやPCRプライマーを得るという方法もありますし、抗体を作って発現ライブラリーを抗体をプローブにスクリーニングする手もあります。 >mRNAを抗体を用いて精製出来ないのではないでしょうか？？？ また、非常にクラシックな方法ですが、細胞のライセートから、抗体で標的タンパク質を合成中のポリソームを落として、そのタンパク質をコードするmRNAだけを精製して、そのcDNAを得るという方法もあります。 とにかく、どこから出発するのかはっきりしないときりがないです。 （もしもですが、、、、宿題か何かでクローニング方法にはどういうものがあるか列挙せよというような課題のための質問でしたら、回答してくれる人たちの仕事のじゃまですので、ご遠慮願います）

？ 削除/引用 No.2796-3 - 2010/06/29 (火) 15:59:15 - K mRNAを抗体を用いて精製出来ないのではないでしょうか？？？

(無題) 削除/引用 No.2796-2 - 2010/06/29 (火) 15:34:18 - 通りがかり > 抗体（値段が高い） 抗体が市販されてるなら、抗原の名前でデータベースを検索して、クローンを買えばいいだけでは。

遺伝子クローニング 削除/引用 No.2796-1 - 2010/06/29 (火) 14:47:08 - toshi T 遺伝子クローニングについて調べてはみたのですが簡便でコストがかからない方法とかがあったら教えて頂きたいです。 調べた方法では、細胞から発現するmRNAを抽出してこのままでは様々なタンパク質をコードしているため抗体（値段が高い）を用いて選択し塩基配列を同定する。

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