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解決 削除/引用 No.2784-5 - 2010/07/12 (月) 16:57:05 - バイオ初心者 解決しました。 ありがとうございました。

ご回答ありがとうございます！ 削除/引用 No.2784-4 - 2010/06/28 (月) 07:16:03 - バイオ初心者 SOD1様、7878様、ご回答ありがとうございます。 参考にして見ます。ありがとうございました。

auto-oxidationもあるしね 削除/引用 No.2784-3 - 2010/06/26 (土) 22:57:15 - 7878 試薬に関してですが， H2DCF-DAはauto-oxidationが指摘されていて，添加時に光曝露してしまうと，バックが高くなります。添加時は部屋を暗くしていますか？ また「最近はもっと良い試薬があるんだからそっちを使って測定しないと認めない」なんてレフェリーに指摘されたりします（経験談）。 必要であればamplex redとかAPF/HPF (hROS検出用)などに切り替えると良いかも知れませんね。

刺激ー＞染色？ 削除/引用 No.2784-2 - 2010/06/26 (土) 22:37:11 - SOD1 PMAで刺激しておいてから，DCFH-DAを添加して測定してみてはいかがでしょうか？ DCFH-DAは”現在”発生している活性酸素種と反応してたまっていくので，どうしても経時的に蛍光強度の自然増加は認められます．また，低温ー＞常温への移行も活性酸素種を一時的に増大させる原因になるでしょう． 1.PMAで刺激 2.DCFH-DAを加えて細胞内へロードする（37℃） 3.そのまま測定する．もしバックが高いようなら，細胞外のDCFH-DAを洗い流す． DCFHをロードする時間，PMAで刺激してからDCFHを添加するまでの時間などを個々のケースで検討する必要はありますよ． がんばってください！

蛍光プレートリーダーを用いた細胞内ROS測定 削除/引用 No.2784-1 - 2010/06/26 (土) 09:15:41 - バイオ初心者 こんにちは。 いつも参考にさせていただいております。 細胞内ROS（活性酸素種）を測定していますが、行き詰っています。 どなたかROS測定に詳しい方がいらっしゃいましたら是非アドバイスをお願いします。 Protocolです 細胞を96well black plateに 2x10^5/well 接種しovernight ↓ 一度培養上清を除き、H2DCF-DA(20uM）を加えたMediumを添加 incubate for 20min at dark 4℃ ↓ HBSSでwellを二度洗浄した後、 HBSSを100ul/well分注し、蛍光プレートリーダにプレートをセット ↓ blankを測定（for 5min） ↓ 刺激物質（PMA）を加えた後すぐに測定（negative conrolとして0.1v/v%DMSO） 現在の問題は、無刺激においても、刺激したのと同程度の蛍光を示すということです。 通常、無刺激では殆どROSは発生しないと思っているのですが、どうもおかしいです。 蛍光強度の上昇は、30〜40倍程度まで見られます。 長くなりましたが、どうかよろしくお願いいたします。

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