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勘違いでした 削除/引用 No.2782-13 - 2010/07/02 (金) 20:38:22 - だい toyoさん、Eireさんへ 情報ありがとうございます。どうやらPierce社から出ている660nm protein assayのことだと勘違いしていたようです。toyoさんの貼り付けてくださったURLへアクセスしてみてわかりました。お二人のおっしゃっていたのはBCA protein assayのことだったのですね。前者ではSDS許容濃度は0.1%ですが、後者では5%のようです。ご迷惑をおかけいたしました。 RIPA bufferを使うのであればBCA protein assayの方がよさそうですね。そちらを検討してみます。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2782-12 - 2010/07/02 (金) 19:41:05 - Eire >だい さん: > Eireさんは特に工夫せずにRIPA bufferで溶解したサンプル濃度を測っていらっしゃったと書かれていますが、SDS濃度についてはどうされたか、教えていただけますか？ Sigma で売っている RIPA buffer (R0278) の組成を参考に作製したので、SDS 濃度は 0.1% です。これで問題なく測定できました。 では、参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.2782-11 - 2010/07/02 (金) 16:48:28 - toyo BCA assayでのサンプル中のSDS濃度上限は5%だったと思いますが、 0.0125%というのは本当でしょうか。 オンラインに資料があればURLを貼ってみてください。 念のため「SDS濃度上限は5%」という資料のURLを貼っておきます。 http://www.thermoscientific.jp/bid/pierce/protein-assay/assay-kit/bca-protein-assay.html

どうもありがとうございます＆もうひとつご質問 削除/引用 No.2782-10 - 2010/07/02 (金) 15:54:34 - だい 皆様、有用な情報を教えていただき、どうもありがとうございます。その後いろいろ情報を集め、どうやらBradford法では界面活性剤の入ったサンプルだと吸光度が飽和しやすくなることがわかりました。 先日Eireさんが教えてくださったPIERCE社のBCA protein assay kitを使えばその問題点が解決するようですので、調べてみましたが、RIPA bufferではSDSの濃度が高すぎて、このkitでも干渉してしまうようです（マニュアルにはSDS濃度は0.0125%未満にするように書かれていますが、RIPAバッファー中のSDS濃度は0.1%です）。 Eireさんは特に工夫せずにRIPA bufferで溶解したサンプル濃度を測っていらっしゃったと書かれていますが、SDS濃度についてはどうされたか、教えていただけますか？他にも同様のご経験がある方がいらっしゃったら、教えていただけると助かります。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2782-9 - 2010/06/27 (日) 21:43:17 - 使い捨てのプラスチックセル >The Bio-Rad Protein Assay, based on the method of Bradford, これは、石英ガラスセル、プラスチックセルの内側に色素がくっついてしまうので、使い捨てのプラスチックセルを使うのではないかと理解してます。 Nanodropの検出部分に色素がくっついてしまうとふき取るのが大変だし、データが一定しないのは、むしろ当然かと思いますがいかがでしょう？

(無題) 削除/引用 No.2782-8 - 2010/06/26 (土) 18:19:33 - Eire Bradford 法では試したことはありませんが、私は BCA kit (PIERCE)を使って nanodrop でタンパクの定量をしていましたが、ちゃんとできてました。サンプルは、だいさんと同じく細胞を RIPA buffer で溶解後、遠心したものを使っていました。細胞は 293T です。スタンダードは BSA を RIPA buffer で希釈したものを使いました。nanodrop にのせる量も、だいさんと同じく 2 ul でした。スタンダードの濃度はだいさんが書かれた濃度の範囲でしたが、非常にきれいな直線に乗りました。反応は添付のマニュアル通りで、特に nanodrop 仕様に工夫すべきことはありませんでした。反応液量はマニュアルの１０分の１くらいにした記憶がありますが、それでもきれいな検量線が引けました。また、上記細胞溶解液のタンパク量を測定したときも、予想の範囲内のタンパク濃度になりましたし、特に測定困難とか、信頼できない値が出たこともありませんでした。 では、ご参考までに。

どうもありがとうございます 削除/引用 No.2782-7 - 2010/06/26 (土) 17:51:17 - だい みなさまへ　nanodropの機械についてあまり予備知識がないまま使用していたことがわかりました。そうなのですね。DNAの濃度測定では非常に有用である印象を自分も持っていたので、そのノリで蛋白濃度も測れればなんて勝手に思ってしまいました。普通のセルを利用する吸光度計はありますので、そちらで従来通り、測ってみるようにします。また、サンプルを濃くするように工夫する方法も試してみようと思います。どうもありがとうございます。

液量が 削除/引用 No.2782-6 - 2010/06/26 (土) 16:54:59 - ema 混ぜた染色液量が500ulもあるなら通常の吸光度計ではだめでしょうか？ もしセルのがもう研究室に無いならELISA Readerのようなものは？ nanodropどうしてもって所はサンプル量が全然ないからとかいう領域だと思うので。 あと薄い領域はだめで濃い領域はOKなら、2.5ulのサンプルを200倍になるような方法でなくもっと濃くなるようにしてはだめでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2782-5 - 2010/06/26 (土) 11:35:09 - inka qqさんの通りです。もともとnanodropは少量のDNAをエチブロと混ぜて紫外線に当てて光り具合を記録する代わりに、DNA量の簡便な測定のために開発されてきた機械で、散乱光の影響を極度に受けやすいので普通の吸光度計のような使い方をしようとすると、無理があります。発売当初はそれでずいぶんクレームが殺到したと聞いています。色素でなくてBCA法などに替えたとしても組織抽出物などのcrudeなサンプルの定量はまずできないでしょう。でも、透明なドロップの定量という本来の目的のためには便利な機械です。

(無題) 削除/引用 No.2782-4 - 2010/06/26 (土) 08:16:10 - qq nanodropは、光路長が短いので、コロイドのような試料の測定に向いていません。更に、光路長が短いので、おそらく1cmあたりの吸光度が10以上であることが必要なのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2782-3 - 2010/06/25 (金) 21:43:38 - うーん 5 minで発色がプラトーになるんですか？ もうしばらく置いて、安定してからはかり直すといいかも？

(無題) 削除/引用 No.2782-2 - 2010/06/25 (金) 21:39:58 - take どこまでを目指している実験でしょうか？ 論文投稿だと、インターナルコントロールを置けとかナントカ言われるので、そこの濃度測定にどのくらいこだわるのが正解か、疑問です。 機械は万能ではありませんから、測定値の直線性が得られる範囲が信頼できる範囲です（説明書に書かれていることは、あなたとは別のラボでの結果ということを忘れず）。 計りたいものが、その範囲外だったら、使っている機械が間違っていると言うことです。

nanodropでのタンパク濃度測定について 削除/引用 No.2782-1 - 2010/06/25 (金) 20:51:01 - だい 今、ある遺伝子の細胞内での発現をウェスタンで確認する実験をしています。流すタンパク量を揃えるために細胞抽出物の濃度測定を行っていますが、最近ラボに入ったばかりのnanodropでの濃度測定にバラツキがあり、困っています。 細胞をRIPAバッファーで回収し、15000rpmで15分遠心、上清を回収した後にサンプル2.5μL＋MQ 397.5μL＋Bioradのprotein assay染色液100μLを調整、ボルテックス後室温5分静置、そのうち2μLをnanodropで測定しています。 nanodropはBradford assayを選び、BSAのコントロールで検量線を引いていますが、その検量線自体も濃度が薄い部分に関してはかなりバラツキがあります。実際のサンプルも、同じサンプルを複数回測定すると濃度が3倍くらいの範囲で上下するため、これだったら見た目の色の具合で判断したほうがよっぽどましだと感じてしまうことが多いです。nanodropで測定する際、液柱はしっかり形成されています。 このような時、最初のサンプル量をたとえば10μLなどに増やして濃度を上げ、高い濃度での測定にすることによって相対的なバラツキを少なくして後で1/4に補正するようなことは意味がありますでしょうか？ ほかに、低いサンプル濃度（たとえば0.5〜1μg/μL）でもバラツキなくnanodropで濃度測定できる工夫など、されている方がいらっしゃったら教えていただけますか。よろしくお願いします。

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