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(無題) 削除/引用 No.2781-4 - 2010/06/28 (月) 18:01:33 - まさき 　ぶんさん、弘法さん、返信どうもありがとうございます。 ご指摘の点、早速確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.2781-3 - 2010/06/25 (金) 21:15:26 - 弘法 長くプレート上で放置してあると、組換えでプラスミドの構造が変わってしまうことは良くあります。G418を含む培地で増殖しているということは、G418耐性遺伝子を持っているということを示すのみで、発現させたいcDNA部分を含んだ完全なプラスミドを持っているとは限りませんから。 対処法としては、発現が確認されたら早い段階でグリセロールストックを作って、常にそこから新たに起こし直したものを発現に用いることです。

(無題) 削除/引用 No.2781-2 - 2010/06/25 (金) 19:20:20 - ぶん 発現が見られなくなった酵母内のプラスミドが正常か確かめましたか？ プラスミドを抽出してみるとか、PCRで目的遺伝子がちゃんと入っているか等 また、RNAレベルでの発現はどうですか？ G418耐性遺伝子がゲノムに入ってしまった場合（プロモーターやターミネーターは何を使っていますか？）や プラスミド上でリコンビネーションが起こってしまって目的遺伝子が抜けてしまった等はありませんか？ また、使用するプロモーターによってはいつも発現しているとは限らない事もあると思います。

組換え酵母による発現形のトラブル 削除/引用 No.2781-1 - 2010/06/25 (金) 16:06:38 - まさき 　酵母（S. cerevisiae）での組換えタンパク質発現系に関して質問です。 　抗生物質G418を用いて組換え酵母をスクリーニングし、リコンビナントを得ました（遺伝子がゲノムDNAに組み込まれるタイプではなく、プラスミドによるマルチコピーです）。このクローンに組み込んだある分泌タンパク質の発現をELISAで確認したところ、発現が確認されました。この発現が確認されたクローンを新しい培地（G418含む）に塗りなおして2日ほど培養した後、4℃で保存しました。それから1週間ほどたってから、この新しい培地に塗りなおしたクローンの分泌タンパク質発現をELISAで再確認したところ、全く発現が見られなくなっていました。 　そのクローンはG418を含む培地で現に増殖しているので、プラスミドが抜けたのではないと思うのですが、だとすると発現しなくなる理由がわかりません。 　G418に限らず、組換え酵母の薬剤耐性スクリーニングで似たような経験をされた方はいますか？その時の対処法ももしわかれば、ぜひ教えていただきたいと思います。

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