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(無題) 削除/引用 No.2770-10 - 2010/06/24 (木) 10:11:59 - ats 以前vector構築のため調べてみると1990年代にいろいろな論文ができていました。 調べられている遺伝子によって異なりますが、 [poly A付加促進配列]-AATAAAコンセンサス-polyA付加部位-poly A付加促進配列=mRNA切断誘導配列-[転写停止配列]ー転写終結配列(数100bp~数kbp) となっているようです。転写終結は複数箇所でダラダラと起こるようです。 [ ]は遺伝子によって発見されていない（調べられていない）配列です。 コンセンサス〜mRNA切断誘導配列のみでもある程度のpolyA付加が生じるようですし、cDNA配列から推定すると複数の3’UTRを持つmRNAを産生する遺伝子も少なくないです。 mikanの実験では、コンセンサス〜mRNA切断誘導配列が残っている（後半のpA siteが使われた）cDNAも混入するでしょうが、もともとpA付加活性は低いからそのようなcDNAが得られたと考えられるので、実際上はさほど問題ないと思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2770-9 - 2010/06/24 (木) 06:54:43 - mikan AP様、適切に整理して頂きありがとうございます。 まさに仰るような問題でした。 >そうするには前半ORF直下のpoly A付加シグナルをはずすしかないと >思いますが、どうでしょう ヌクレアーゼ(ポリメラーゼ?)などでPolyAテールは外せると思いますが、 poly A付加シグナルを外すのは、ライブラリ規模で技術的に可能なのか わかりませんでした。 ダブルのpoly A付加シグナルがあった場合や、上流の遺伝子が異なった場合 (過去のIRESに関する書き込みを参照)IRES以降の遺伝子発現が、上流遺伝子 の発現と必ずしも連動しないと考えた場合、（このケースでは）わざわざ IRESを繋がなくても良い気がしてきました。 導入効率のモニタリング(発現効率でなく)だけなら、別プロモーターを繋ぐ のが楽かもしれません。 もちろん、pEX-LibのようなIRES-薬剤耐性遺伝子の場合、別なメリットが あるとは思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2770-8 - 2010/06/24 (木) 00:04:46 - AP ということは、ひとつの転写単位のなかに複数のpoly A付加シグナルがあった場合どうなるかという問題に還元できると思います。 内在性の遺伝子の多くの例からいうなら、どのpoly A付加シグナルをもってpoly A tailが付加されるかはby-chanceとしか言えないと思います（たとえばUTRからなる第一エクソンと、ずっと下流の最終エクソンの両方にpoly A付加シグナルがある遺伝子で、前者でpoly A tailが付加された、タンパク質をコードしない転写産物の方が大部分という例もあります）。おそらく、前半のORF+poly A+と、前半ORF＋IRES+k後半ORF+poly A+の転写産物がある比率で混在することになると思います。後者の転写産物のみなら話は簡単だと思いますが、そうするには前半ORF直下のpoly A付加シグナルをはずすしかないと思いますが、どうでしょうか。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2770-7 - 2010/06/23 (水) 23:25:02 - mikan 御教授ありがとうございます。 目的を書いて無くて、申し訳ありません。 cDNA発現ライブラリは、培養細胞でトランスフェクションして、 特定の表現型をクローニングをするために使います。 >つぎはIRES の調べ勉強をしてください。 つまり、例え切られても核外に運ばれ、RNAウイルスのようにIRESから 再び翻訳されるので、問題ないということでしょうか？ 宜しく御願いいたします。

有り難うございます。 削除/引用 No.2770-6 - 2010/06/23 (水) 23:11:08 - mikan 貴重な御意見、ありがとうございます。 >転写後、poly(A) シグナルによりmRNA が切られるので、下流の遺伝子が 発現しない ということは、IRES-XXXは、poly(A) シグナルにより切られて 翻訳されないということでしょうか。 >ベクターマップで「poly(A)シグナル」だけでなく、「転写終結点」もチェックしてください。 ありがとうございます。チェックしてみます。 <IRES-(NFP or Luc or Drug resistance gene)-PolyA付加シグナル> の最後のPolyA付加シグナルは、市販のベクターに良くあるSV40由来か BGHなどの予定です。IRESの上流にあるGeneX-PolyAは、cDNA library 構築のための、培養細胞由来の不特定多数の遺伝子群です。

(無題) 削除/引用 No.2770-5 - 2010/06/23 (水) 23:06:48 - AP 教科書的レベルの話でしかなくて、実際はいろいろな事象があるかもしれませんが、 大腸菌などの原核生物は転写終結配列があってそこで転写が終結します。 それに対して、真核生物では転写終結を決定付ける配列はなくて、だらだら転写されそのあとで、poly A付加シグナルにしたがってpoly A tailが付いた形に編集されます。 真核生物由来のcDNAでも原核生物を宿主にクローニングしている、、、それで理解できる話ではないですか？

転写終結シグナル 削除/引用 No.2770-4 - 2010/06/23 (水) 23:05:55 - take つぎはIRES の調べ勉強をしてください。

転写終結シグナル(追記) 削除/引用 No.2770-3 - 2010/06/23 (水) 22:56:12 - mikan 自己レスです。 酵母をやっている方のページから転載です。 http://www5.pf-x.net/~pombe/information/transcription,html.html >RNAポリメラーゼIIは特定の場所で転写終結するわけではなく、mRNAの >ポリAシグナル(AAUAAA)を通過しても止まらない。しかし、プレmRNAの >ポリA部位の下流にはCoTC(転写共役的切断)活性をもつ配列があり、 >それによってCoTCの上流が切断され、続いてエキソヌクレアーゼによって >下流のプレmRNAが分解され、結果的にRNAポリメラーゼIIが鋳型から離れる。 >つまり、CoTCは酵素活性をもつRNA、リボザイムである。 PolyA付加プロセスが酵母と同じなら、少なくともダラダラと転写さえされて いれば、mRNA自体はCoTCを含まないみたいなので、cDNAをベクターに 組み込んでも、エキソヌクレアーゼで端から切断されて、PolyAが付加され、 以降の配列は、翻訳されないといったことは、無いんでしょうか・・・。 でも、IRES-XXは、1kbくらいはありそうです。

転写終結シグナル 削除/引用 No.2770-2 - 2010/06/23 (水) 22:53:24 - take poly(A) シグナルの下流に転写終結点があります。 しかし、AAAAAAAAA はpoly(A) シグナルと転写集結点の間に付きます。 よって、cDNA には転写集結点がありません。 タカラや理研から販売されているloxP-Neo-loxP タイプのベクターは、Neoの直下流にpoly(A) シグナルを持っていますが、転写そのものはloxP の下流につないだ目的遺伝子も含んでされます。転写後、poly(A) シグナルによりmRNA が切られるので、下流の遺伝子が発現しないのだ、と開発者の斎藤先生の講演で聞いたことがあります。 ベクターマップで「poly(A)シグナル」だけでなく、「転写終結点」もチェックしてください。poly(A) シグナルとして使っているのが、何の遺伝子のどの領域かで、実は転写が終わっていないかも。

転写終結シグナル 削除/引用 No.2770-1 - 2010/06/23 (水) 22:37:29 - mikan いつも大変参考にさせて頂いております。 今回は、cDNA発現ライブラリ(哺乳類)を構築する際のベクター設計で、 迷っておりまして、御意見をお聴かせ願いたいと思っています。 通常、Oligo dTで３末端から合成したcDNAには、恐らくPolyA付加シグナルが あり、そこから少し離れた地点に終結点(シグナル？)があると思っています。 もし、そのcDNAの下流に、<IRES-(NFP or Luc or Drug resistance gene)- PolyA付加シグナル>を入れた場合、転写はどこで終結するのでしょうか。 例えば、pEXP-Lib(Clontechの)のような構造のベクター/ライブラリが売られ ているので、恐らく最後まで転写されるのかもしれませんが、 確信がありません。 勉強不足でしたら申し訳ありません。 宜しく御願いいたします。

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