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(無題) 削除/引用 No.2768-8 - 2010/07/01 (木) 21:16:24 - YMR みなさま、大変勉強になる書き込みをしていただきありがとうございました。 メチルセルロース培地は、よっしーさんもおっしゃるように次回是非試してみたいと思いました。 ところで、少し質問が変わってしまうのですが、実は前回ハイブリドーマを９６穴プレートにまき陽性反応を示したウェルの細胞を用いて10倍、100倍、1000倍と限界希釈しその中で1000倍希釈したものをサンプルとし、陽性反応を示したウェルに生えている細胞を液体窒素保存しました。しかし、その細胞を起こした際、抗体価を確かめたところ結果は陰性でした。 ・保存までの期間は1000倍希釈の陽性反応を確認してから1ヶ月程度 ・陽性反応を確認した際の抗体価は高かった ・スクリーニングとして用いた方法はドットブロット このようなことから陽性反応が見られなくなった理由は何が考えられるのでしょうか？ 私自身の考えとしては、 ・保存までの一ヶ月の間に細胞が抗体産生しなくなった ・1000倍希釈だけでは限界希釈が十分ではなかった ・保存に問題があった などを考えていますが、他に何か考えられることがありましたら助言お願いします。

(無題) 削除/引用 No.2768-7 - 2010/06/25 (金) 09:59:04 - よっしー 私もcさまと同意見です． 非科学的かもしれませんが，うまくワークしている人から， ミエローマをもらうのが手っ取り早いと思います． HATも推奨濃度で． cさま メチルセルロース培地ですか．勉強になりました． 次回はトライしてみたいと思います．

(無題) 削除/引用 No.2768-6 - 2010/06/25 (金) 09:48:01 - ｃ ポリクロに十分な抗体値があるなら、あとはミエローマの 状態と融合効率ですね。 私も質問者様と同様のことが過去にあり、マイコプラズマ感染が 原因だったかは不明ですが、ミエローマを新しく購入することで 効率良くモノクロが取れた経験があります。 あと融合後の培養ですが、私がいるラボでは96wellプレート播種では なく、専らHAT含有メチルセルロース培地でコロニーを選別しています。 ピペットマンで１つ１つコロニーを目視で確認しながらピックアップで きるので、コロニーを見落とす確率が低くなります。また、クローニング が不要というのも魅力です。試してみる価値はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.2768-5 - 2010/06/25 (金) 03:21:41 - YMR ats様、ｍAb様 ご返信ありがとうございます。 マウスの抗体価自体は十分に上がっており問題はありませんでした。 融合率は低いのですが、問題はない程度です。マイコプラズマ感染については理解不足のため成書を確認したいと思います。 何はともあれ、まずお二人のご指摘とおりに実験で確かめてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2768-4 - 2010/06/24 (木) 15:02:04 - mAb ＨＡＴは推奨濃度で問題ないと思います。 ちなみに、ミエローマのみをＨＡＴで培養して全滅しますか？ もし全滅していないなら、セレクションが効いていないことになります。 また、マウスの抗体価は上がってますか？ いいモノクロを取るためには、重要なポイントです。

(無題) 削除/引用 No.2768-3 - 2010/06/24 (木) 10:23:37 - ats > もしかしたらミエローマ細胞がなくなりきっていないのかと と思っているなら、質問するより即実験で確かめましょう。 HATは自作ではなく既製品を使っているとして、標準量の半量〜2倍くらいを調べるので十分だと思います。 成書を読めば沢山のトラブルシューティングは記載されていますが、例えば融合率・マイコプラズマ感染は大丈夫ですか？

モノクローナル抗体の抗体価 削除/引用 No.2768-1 - 2010/06/23 (水) 22:22:41 - YMR 研究室にてモノクローナル抗体を作成中のものです。 マウスに免疫した後、スクリーニングを行う際、まずHAT培地にて培養を行うと思うのですが、皆様はHAT培地にてどれくらいの濃度でどれくらいの期間培養されているのでしょうか？ なかなかモノクローナル抗体が確立できないため、もしかしたらミエローマ細胞がなくなりきっていないのかと思い質問させていただきました。 よろしくお願いします。

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