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大腸菌でのタンパク質発現 削除/引用 No.2762-6 - 2010/06/23 (水) 22:36:09 - take ＞レフト様 関係ない話を持ち出して、ごめんなさい。 ご存知のようにBL21 とBL21(DE3) の区別なく語る方がいらっしゃるので、付け足しただけです。 恥ずかしながら、うちのラボに【本当に】BL21 を購入してしまって、タンパク発現まで数ヶ月を捨てたポスドクがいましたので。Gal4検出に抗b-gal抗体でがんばった人もいました。 どうでもいい話でごめんなさい。 なお、JM109(DE3) は、DE3つながりで出しただけです。

(無題) 削除/引用 No.2762-5 - 2010/06/23 (水) 18:12:34 - レフト > こんなことがあるのでしょうか？ 不溶性になる場合としては典型例の一つでしょう。 > また、可溶性タンパク質を得るためにはどのようにしたらいいのでしょうか？（低温18℃、25℃、IPTG濃度を下げてタンパク質を発現させても同じような結果です。） 宿主株にもよりますが、14℃まで下げてようやく上清に出るようになったケースがありました。 他に培地をpoorにする（Ｍ９など）、培地の浸透圧を上げるなどが有効な場合もあるようです。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1865119/ ＞take様、 pGEXベクターはtacプロモーターなのでλDE3は無用です。

大腸菌でのタンパク質発現 削除/引用 No.2762-3 - 2010/06/23 (水) 17:43:21 - take 蛋白質精製に、これさえやればＯＫというのはないので、朝一番のように可能性を考えてつぶしていくしかない。 参考 蛋白質科学会アーカイブ http://www.pssj.jp/archives/index.html メルク−ノバジェンのカタログも役に立ちます。 BL21ではなく、BL21(DE3) ですよね？ K12系で、JM109(DE3) というのも有ります。

(無題) 削除/引用 No.2762-2 - 2010/06/23 (水) 06:41:37 - 朝一番 目的タンパク質ができても、残念ながら不溶性ということはままあります。 現状の発現ベクターで工夫する余地としては、 １．抽出バッファを工夫する。 ２．ＩＰＴＧ濃度を下げる、またはＩＰＴＧなしにする。Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地を使う。 ３．大腸菌シャペロンプラスミドを導入し、共発現させる。 ４．Ｋ株系の菌を宿主に使う。 ５．２，３，４と低温培養を組み合わせる。 などありますが、過剰な期待はしないほうが良いです。現時点でわずか（１％以下）でも可溶性に回収できるのであれば試してみる価値はあります。 ６．ＭＢＰべくたーなど発現コンストラクトの変更 ７．大腸菌をあきらめる のも一つの手です。

大腸菌でのタンパク質発現 削除/引用 No.2762-1 - 2010/06/22 (火) 21:01:44 - mamota 現在、大腸菌BL21を用いてタンパク質発現系構築を行っています。 使用しているベクターはpGEX 4T-3です。 IPTGを添加し、タンパク質を発現させSDS-PAGE、ウエスタンブロットで発現タンパク質を確認しました。 SDS-PAGEでは、総タンパク質の太いバンドが確認され、ウエスタンでもバンドが確認されました。 しかし可溶性画分には、目的のサイズの箇所にバンドがなく、ウエスタンをしても検出できませんでした。 また、GSTタグの26kDa付近に時間経過とともに太くなっているバンドがみられ、融合タンパク質が切断されてしまったのかなと思っています。 こんなことがあるのでしょうか？ また、可溶性タンパク質を得るためにはどのようにしたらいいのでしょうか？（低温18℃、25℃、IPTG濃度を下げてタンパク質を発現させても同じような結果です。）

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