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(無題) 削除/引用 No.2759-11 - 2010/06/23 (水) 13:07:49 - dd ＞~さん 調べたところ某社が研究開発に用いていたようなので、使用に至りました。 質問では伏せていましたが、SOD-の大腸菌株をホストにし、ベクターを変更して活性確認した際、野生株に迫る（でも優性は見られなかった）活性が確認されたので異種間でも発現はしている…と判断しました。 ただご指摘を頂いたように精製以外にもやることが多く、キットについてもまだ使用規模を追及する必要があると感じました。 重ね重ねありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2759-10 - 2010/06/23 (水) 09:46:05 - ~ >プロトコルには純水を用いてSOD測定系を確認できるようになっています このキットは血清中のSOD活性を測定するためのものに見えます。 このキットで大腸菌中のSOD活性を測定することが出来ることは、 メーカーかどこかのグループが報告しているのでしょうか？ キットに添付されていなくても、トラブルが起きたときは自分でリコンビナントを用意して、キットできちんと測れていることを確認する必要があるのではないでしょうか。 >やはり精製できればより正確な比較を行う実験への架け橋になれるかな それもいいですけど、 そもそも異種SODが発現しているかのチェックもせず、 キットがきちんとはかれているかの確認もしていないので、 精製より前に出来ることは多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2759-9 - 2010/06/22 (火) 20:37:21 - dd プロトコルには純水を用いてSOD測定系を確認できるようになっています（つまりサンプルを試験せず酵素と基質反応のみを見れる）。 そこからサンプルを検体として扱い、盲検は酵素液を用いずブランク液なるものを付属してくれているキットを用いています。 http://www.info.pmda.go.jp/tgo/pack/16300AMZ00285000_A_01_01/ タンパク液は凍結せず、4℃で遮光保存していますが、抽出方法も含め、改めてもう一度検討して指導教員と話してみます。 ＞SODは詳しくありませんが、大腸菌は通性嫌気性なので 異種のSODはグラム陽性菌なので、現在同性のBacillus属をホストにして改めて実験をやり直そうと考えています。ただそれだと今度は逆に好気性になるため、ストレスがかからずSODの発現は誘導されにくくなるのでしょうか…。 ご指摘の通り、文献調査も並行していこうと思います。 また、現在は精製が目的ではないので（ていうか言い辛かったんですけどウチの研究室にそこまでできて確認できる設備が…）すが、やはり精製できればより正確な比較を行う実験への架け橋になれるかな…と思います。 また長々でしたが、今ヘタなりに考えたことはこんなカンジです。 改めまして、ご指摘&回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2759-8 - 2010/06/22 (火) 19:21:23 - ~ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10743616 全く読んでいませんが、異種SODの大腸菌での発現の報告が無いわけではありませんよね。 種によってどの位変わるのかは分かりませんが、 発現時の条件や活性の測定方法については既に報告されているのではないでしょうか。 >それでもやはり、SODのみを回収したほうが確実でしょうか…？ 目的が分からないので、それが効率的かが分かりません。 目的は、 �@、�A、�BのSOD活性の比較でしょうか。 �AからのSODの精製でしょうか。 比較が目的であれば、もう少しSOD活性の測定方法について予備検討が必要だと思います。 精製が目的であれば、タンパク質量の確認や、精製方法の検討が目的の達成に近づく方法だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2759-7 - 2010/06/22 (火) 17:59:54 - ザンギ SOD活性測定がちゃんと出来てるとしての話ですが。 遺伝子導入株では選択薬剤の影響でSOD遺伝子の翻訳等が抑制されてる可能性 はあると思います。遺伝子導入株の生理実験では測定時だけ選択薬剤を培地 から除くこともあります。 選択薬剤入りで培養してるのなら、 （２）＞（３） でポジティブに考えてもいいと思います。 SODは詳しくありませんが、大腸菌は通性嫌気性なので通常のエアのリッチな 培養では、野生株では酸素（酸化）ストレスがかかってSODが誘導されてる ということはないでしょうか。 大腸菌の内因性SODの発現条件を文献調査されてはいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2759-6 - 2010/06/22 (火) 17:07:43 - in situ ~さまも指摘されていますが、ポジコンを置いて、SODの測定系が動いていることは確認できていますか？ ・抽出方法、保存方法がまずい ・試薬がへたっている などの理由で、測定系自体が働いていない可能性も考慮しないといけません。 triplicateによる手技誤差とはまた別の問題です。

(無題) 削除/引用 No.2759-5 - 2010/06/22 (火) 16:33:52 - dd ＞スケプティクスさん 回答有難うございます。 3度同じ測定を行い、どれも標準偏差は低かったので誤差もあまり無かったです。

(無題) 削除/引用 No.2759-4 - 2010/06/22 (火) 16:22:39 - スケプティクス いずれも活性ゼロで、見られた違いは誤差範囲内ということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2759-3 - 2010/06/22 (火) 16:10:25 - dd ＞~さん 回答有難うございます。 タンパク定量は行っています。全菌体由来のタンパクも1000ng/μlに補正し、それらの活性を測定しています。 （↑の詳細）：タンパク回収前の菌体培養では、やはり増殖速度に違いはありますが、全てOD600：0.4〜0.5で回収しています（先に吸光度に至った菌体は冷蔵庫において反応を止めています）。タンパク抽出後は当然タンパク定量の際濃度の違いが見られますが、それは生理食塩水による希釈で補正している…。といったカンジです。 それでもやはり、SODのみを回収したほうが確実でしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.2759-2 - 2010/06/22 (火) 15:56:26 - ~ そもそも、�AでSODのタンパク質量は見ているのですか？ SODの測定系がきちんと働いていないという可能性は消せていますか？ -リコンビナントのSODでの添加回収実験などはされているのでしょうか？ -サンプリングや測定の順番を�B、�A、�@にしたら、活性が�B＞�A＞�@になったりしませんか？ 菌体の持ち込み量は菌数で揃っているのでしょうか？ -ベクター無しが一番増殖が速いために、培地量あたりの菌数が多く、 培地量あたりで酵素活性を測定しているために、 菌数が多い�@の活性が高くなったりしていませんか？

形質転換による酵素への影響 削除/引用 No.2759-1 - 2010/06/22 (火) 14:46:56 - dd 大腸菌を用いて形質転換を行い、SODの酵素活性を試みました。 菌体サンプルは以下の通りです。 �@大腸菌のみ �A他種由来のSOD遺伝子をベクターに導入して形質転換した大腸菌 �B�AのSOD遺伝子なし。つまりベクターのみ形質転換した大腸菌 SOD活性の予想は �@＝�B＜�A でしたが、実際は �@＞�A＞�B でした。 �@＞�Aに関して： �Aは多種由来なので、過剰発現による細胞毒性が起こり、活性が低下したと考えました。また、異種間発現によるコドン使用頻度の違いによる低コピー発現が原因とも考えました。 ただ �@＞�Bになった理由が考え難いです。 ベクターオンリーの大腸菌であれば、発現アリナシ以前の問題なので、�@＝�Bにならないとおかしいと考えましたが、これは形質転換の影響でしょうか？ 素人意見ですが、ご意見を頂けるとうれしいです。 よろしくお願いします。

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