全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2755-11 - 2010/06/25 (金) 00:59:49 - じぇい 皆さん ありがとうございます！！ 理解できました　：）

正解 削除/引用 No.2755-10 - 2010/06/23 (水) 21:25:38 - DDD 一本のプライマーでも増幅は可能だが、指数関数的に増幅できない。 増幅量はAPさんの指摘の通りですので可視化する量にできてないってわけです。 >インサートＡの両脇に結合する２つのプライマーを使用し、ＰＣＲを行いました。 これっておそらくベクター上のプライマーって意味ですよね？ PCRの目的が書かれていないので推測になりますが インサートチェックならば、ベクター上とインサートのプライマーでPCRを かける方がいいです。 そうすれば プライマーがきちんと動けば インサートなし(バンドなし)インサートあり(バンドあり) って感じになります。 また、長さも9000bpは長すぎますのでもう少し短い長さのバンドで判別する方がいいですね。まぁ酵素を選択すれば9000bpでも可能です。

(無題) 削除/引用 No.2755-9 - 2010/06/23 (水) 10:14:25 - AP ちなみに、9000 bpのPCRはけっこう長いので、むちゃくちゃ難しくはないけれど、そうそう簡単でもないです。増幅効率1.0はとても望めませんし、単純に伸長時間を延ばせばうまくいくという保証もないです。

(無題) 削除/引用 No.2755-8 - 2010/06/23 (水) 10:09:49 - AP 例えば、増幅効率が1.0 (1サイクルごとに確実に2倍になっていく）としたら、20サイクルPCRして2^20倍、約10^6倍です。 これが、合成鎖が反対側のプライマーアニーリングサイトまでのびないとか、片方のプライマーしかいれないとか、だと常に最初に投じた鋳型からしか合成がおこらないので、20サイクルで20倍です。 10^6 vs 20だと20はほとんど無視できます。 10^6倍で1 ugの収量があったとしても、20倍では20 pgにしかなりません。 て、いまさら説明することでもないか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2755-7 - 2010/06/23 (水) 09:41:37 - R >各サイクルで端から端まで増幅できないので プライマー1本だと仮に端まで伸びても、指数関数的には増えないです。 templateも増えないと増幅はしてもchain reactionにはならないです。 1サイクル毎に絵を描いてみるとよく分かると思います。 蛇足かもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.2755-6 - 2010/06/23 (水) 00:18:37 - じぇい 皆さん コメントありがとうございます。 理解した点ですが・・・ インサートの全領域を増幅する際、ＰＣＲサイクルの伸張時間が短すぎれば、たとえ２０〜３０サイクルでテンプレートを増幅させても、各サイクルで端から端まで増幅できないので、一度に増幅できる数は指数関数的には増幅しないということでしょうか？ 増幅しても、ゲルで可視化することが困難という理解でよろしいでしょうか？ 一本のプライマーでも増幅は可能だが、指数関数的に増幅できないわけですよね。

本筋ではないですが 削除/引用 No.2755-5 - 2010/06/22 (火) 11:18:28 - ats > インサートが入っているプラスミドがあります。インサートＡの両脇に結合する２つのプライマーを使用し、> �@インサートが入っていないサンプルでは短いＰＣＲプロダクトが増幅されました。→ＯＫ ここのOKという認識は間違っていますよ。

(無題) 削除/引用 No.2755-4 - 2010/06/22 (火) 09:22:45 - ~ >なにかしらバンドが見えてもよいのではないのでしょうか？ 見えてもいいですけど、見えなくてもいいでしょう。 検出限界を無視していませんか？ PAGEで流してEtBr染色すれば、何かしらのバンドが見えるかもしれません。 >もしそうなら短いバンドが見えてもよいのではないでしょうか？ それを検出できるような条件で泳動したのですか？ シングルストランドのDNAや、テンプレートのプラスミドと結合したままのDNAを検出できるような条件で流しているとは書かれていませんね。 >そもそもＰＣＲで１本ではなく２本のプライマーを用いて増幅する理由は何なんですか？ 目的の配列を増幅させるためです。 貴方がそのPCRを行なったのも、その目的を達成するためでは？ >また1本の場合は何も増幅されないのですか？ テンプレート、プライマー、他の条件等によっては増幅することはあります。

(無題) 削除/引用 No.2755-3 - 2010/06/21 (月) 23:05:36 - DDD >また1本の場合は何も増幅されないのですか？ >どなたかぜひ教えてください 増幅されます この類の質問過去にもあった記憶が… なぜ見えないのかについては amiさんが素晴らしいヒントをくれてるので考えてみましょう

(無題) 削除/引用 No.2755-2 - 2010/06/21 (月) 22:54:59 - ami 【ヒント】 PCRは何の略ですか

ＰＣＲでバンドが見えない 削除/引用 No.2755-1 - 2010/06/21 (月) 22:29:41 - じぇい インサートが入っているプラスミドがあります。インサートＡの両脇に結合する２つのプライマーを使用し、ＰＣＲを行いました。 結果: �@インサートが入っていないサンプルでは短いＰＣＲプロダクトが増幅されました。→ＯＫ �Aインサートが導入されたサンプルでは、ＰＣＲプロダクトが増幅されませんでした。→？　（インサートは導入確認済みです。） インサートの長さが9000bpなので、伸張時間が短すぎるからだと結論できるのですが、仮に伸張時間が短すぎたとしても、なにかしらバンドが見えてもよいのではないのでしょうか？ 両脇にアニールしたプライマーが伸張し、伸張時間分の断片を両末端で増やすことはできます。インサートの両末端から伸張されて、最後に付加された塩基同士の間は増幅されないことになります。もしそうなら短いバンドが見えてもよいのではないでしょうか？ これはある意味、ＰＣＲで増幅したい領域を1本のプライマーを用いて行っているようなものです。そもそもＰＣＲで１本ではなく２本のプライマーを用いて増幅する理由は何なんですか？ また1本の場合は何も増幅されないのですか？ どなたかぜひ教えてください

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---