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私も 削除/引用 No.2746-5 - 2010/06/21 (月) 22:40:33 - GB250 GAPDHは推奨しません。 今まで結構変動するところを見てきましたし。 18Sを推奨する事が多いようですが、私はPpiaを愛用しています。 ちなみにほとんど変動しません。 お勧めです。

(無題) 削除/引用 No.2746-4 - 2010/06/21 (月) 13:31:55 - toyo RT-PCRの内在性コントロールとして適切な遺伝子は、研究対象の実験系によって 変わるので、どんな実験系でもGAPDHが使えるとは限らないと思います。 そもそも内在性コントロールのきちんとした定義は 「他の遺伝子のmRNA量の変化をもっともよく説明できる遺伝子」 ということになります。 つまり内在性コントロールのmRNA量が変動していること自体は問題ではなく、 他の多くの遺伝子のmRNA量の変動を説明できないことが問題です。 類似の実験系で用いられる遺伝子を候補にしながら、複数の遺伝子について 試して、自分の系に適切なものを選択する必要があると思います。 蛇足ですが、比較対象のmRNAと同じくらいの発現を示している遺伝子を内在性 コントロールとして用いたほうがよいです。 18S rRNAは総量として安定していますがかなり大量に発現していることが多く、 微量しか発現していない遺伝子の定量には不向きかもしれません。 参考URL http://www.appliedbiosystems.jp/website/jp/biobeat/contents.jsp?TYPE=C&COLUMNCD=76448&COLUMNPGCD=78855

(無題) 削除/引用 No.2746-3 - 2010/06/20 (日) 23:48:33 - あべちゃん 実験によってどうしてもGAPDHが変動してしまうことはあります。 従って私の場合、GAPDHの他にアクチン（ACTB)、PGK、18S rRNAを用意しています。 めったにqRT-PCRしないのであれば複数用意する必要もないのですが、今回のようなケースは不運ながらGAPDHが使えない可能性が考えられます。 個人的な意見ですが、18Sが安定しているような気がします。 注意すべき点は、オリゴdTで逆転写してはいけないという所です。

(無題) 削除/引用 No.2746-2 - 2010/06/19 (土) 16:14:33 - ats あくまでも推測ですが、... 交換する培地はしっかり温めてあり温度変化の影響がないとして、 GAPDHは解糖系酵素ですから培地中のグルコース濃度が変わる(新しい培地でグルコース濃度が増える）と変動するのではないでしょうか。 どのような刺激を与えるのか不明ですが、培地交換しない方法を採用するか、培地交換後のネガコンを対照とするしかないかもしれませんね。 また、GAPDHは低酸素で変動（上昇？）するそうです。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1231 培地交換によって酸素分圧も変動するのかな？ 変動がすくない他の遺伝子を使うのが良いかも。

内部コントロール 削除/引用 No.2746-1 - 2010/06/18 (金) 20:47:55 - satoh 培養細胞で薬剤刺激実験を行い、ある遺伝子の変動をRT-PCRで調べています。 その結果、刺激前と刺激後3時間のネガコン（培養用培地を投与）でその遺伝子が大きく変動していました。 おかしいと思い、RT-PCRの数値を見てみると、内部コントロールのGAPDHの値が変動していたため、そのようになっていたようです（トリプケイトで値自体にバラツキは見られませんでした）。 そこで、再度、実験を行ったところ、同じような結果でした。 培養用培地を添加しただけで、GAPDHが変動することはあるのでしょうか？ それとも、GAPDHのプローブがおかしくなっているのでしょうか？ 何か思い当たる節がありましたら、ご教授下さい。

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