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結果の報告です 削除/引用 No.2732-11 - 2010/06/23 (水) 08:14:06 - あき 50KDaのFLAGtagつき蛋白質をHeLaに強制発現して、IPはMouse-anti-FLAG(M2) 2ug、IB（一次抗体）は、Rabbit anti-DYKDDDK(x2000)、２次抗体はanti-Rabbit HRP, Cell Signaling(x2500)を用いて検出しました。ネガコンとして、Normal mouse IgG (SantaCruz)をIPに使用しました。結果としては、ご指摘の通り多少のIgGのHC、LCが認められるも、過剰発現された蛋白を検出する程度の露光時間ではほとんど影響がありませんでした。ありがとうございました、大変参考になりました。次の実験に進みたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2732-10 - 2010/06/17 (木) 23:02:14 - あき 皆様の親身なアドバイスありがとうございます。 発現は確認できております。 良好な結果が得られる可能性が十分にあると理解しました、ご指摘の通り２次抗体の選択とコントロールに十分配慮して実験を行いたいと思います。 週末には結果をフィードバックさせていただきます。取り急ぎお礼まで。

(無題) 削除/引用 No.2732-9 - 2010/06/17 (木) 19:24:03 - PDI ネガコン、ポジコンをしっかり置いて実験をするしかないと思います。 ちなみに、トランスフェクタントを流して50kDaにシグナルを確認してますか？ 目的タンパクが発現してなければＩＰどうこうの話ではないですよね。

(無題) 削除/引用 No.2732-8 - 2010/06/17 (木) 10:42:58 - TS つまり、組み合わせとしては、うまくいく可能性が十分にあると言うことです。同じような実験で、うまくいっているヒトはたくさんいます。（うまく行くことの方が多いと思います） ただし、他の人がおっしゃっているように、二次抗体の質次第だと思います。 また言い切って良いかわかりませんが、抗体1-3μｇくらいでSDS-pageでスメアになるようなことも起こりにくいと思いますが、目的タンパク質次第かもしれません。 なので、もはや、やってみてくださいとしか、誰も言えないと思います。 だめなら、すでに出ておりますが、True blotかHRP標識抗体が対応策になると思います。ちなみにTrue blot、サンプルもらえるかもしれませんよ。３ヶ月くらい前だったか、もらいました。

(無題) 削除/引用 No.2732-7 - 2010/06/17 (木) 05:27:50 - 東海岸ポスドク シグマのHRP-conjugated M2 anti-FLAG抗体で検出するとIgGの心配をする必要はないですし、感度も特異度も非常によい抗体です。そうでなければ、FLAGペプチドで溶出する方法もあります。

具体的な実験内容を追加しました 削除/引用 No.2732-6 - 2010/06/17 (木) 01:37:38 - あき 私の間違いをご指摘いただき感謝いたします。 ＞ＩＰでマウス、ＩＢでラビットの抗体を使用しているので、二次抗体は抗ラビットですよね。なので、ほとんどの場合、IPで使用したマウス抗体の重鎖、軽鎖はIBで検出されないと思います。 まさに、上記ご指摘の部分をお聞きするつもりでした。 実際には、50KDaのFLAGtagつき蛋白質をHeLaに強制発現して、IPはMouse-anti-FLAG、IBはRabbit anti-DYKDDDK、２次抗体はanti-Rabbit HRPを用いて検出すれば、HCで目的の蛋白質が隠れたり抗体によるスメアができたりはしないかどうかを心配していました。 吸着処理については、２次抗体のdata sheetを参照すればいいのですね。 交叉性：全種の意味も納得できました。 結論としては上記の実験は有効と考えられますでしょうか？ぜひともご教示お願いいたします。

何かおかしくないのでしょうか。。。 削除/引用 No.2732-5 - 2010/06/16 (水) 23:46:32 - TS 私の勘違いでなければ、 Anti-mouse FLAGではなく、Mouse-anti-FLAGですよね？ Anti-Rabbit DYKDDDDK抗体ではなく、Rabbit anti-DYKDDDKではないでしょうか？ そうだとして、問題となるのは、ＩＢに使う二次抗体の交差性ではないですか？ ＩＰでマウス、ＩＢでラビットの抗体を使用しているので、二次抗体は抗ラビットですよね。なので、ほとんどの場合、IPで使用したマウス抗体の重鎖、軽鎖はIBで検出されないと思います。 さらに、PDIさんがおっしゃってるように、二次抗体のデータシートを見ると、多くの二次抗体では、ラビット以外のどれかのIgGに吸収処理をしている、と書いてありますので、それがマウスであれば、なおさら安心、ということです。 一次抗体のCSTのデータシートに、交差性：全種と書いてあるのは、これはタグに対する抗体ですから、種差という概念はないということだと思うんですが。違うかな。。。

(無題) 削除/引用 No.2732-4 - 2010/06/16 (水) 23:40:40 - フラグ Anti-Rabbit DYKDDDDK抗体ではなく、Rabbit Anti-DYKDDDDK抗体なのでは？ 最初のご質問については、使う二次抗体によりけりとしか答えられません。

(無題) 削除/引用 No.2732-3 - 2010/06/16 (水) 23:05:32 - あき ご回答ありがとうございます。確認させていただきたいのですが、IBに使用するAnti-Rabbit DYKDDDDK抗体(Cell Signaling)のdata sheetにはSpecies Cross-ReactivityがAllと記載されていますので、IPでAnti-mouse FLAG M2抗体を用いる場合は、IgGのHC、LCは検出されてしまう、という理解でよろしいですか？

(無題) 削除/引用 No.2732-2 - 2010/06/16 (水) 09:58:52 - PDI > IPとIBに用いる抗体の種を変えれば原則的には同様の効果が得られるのでしょうか 検出に使用する抗体がIPに使用した動物種のIgと交叉するかデータシートで調べてみてください。吸収処理の有無が記載されているはずです。 ＞True Blotを使った方がきれいに消えますか？ぜひ皆様のご経験をご教示ください。 TrueBlotの効果は絶大です。ただし、検出感度をあげたり、露光時間を伸ばすとHCおよびLCのバンドがじわじわと検出されてきます。 ターゲットの分子量が完全にHCおよびLCと重なっている場合は、IP用抗体とビーズをクロスリンクして持ち込むIP抗体を減らす等の工夫が必要かと思います。

IP後に検出されるIgGのHCとLCを消す方法について 削除/引用 No.2732-1 - 2010/06/16 (水) 08:37:58 - あき Anti-FLAG M2抗体でIPした後にAnti-Rabbit DYKDDDDK抗体(Cell Signaling)でIBすると、IgGのHCとLCは実際に検出されなくなりますか？また他の抗体においても、IPとIBに用いる抗体の種を変えれば原則的には同様の効果が得られるのでしょうか、またはTrue Blotを使った方がきれいに消えますか？ぜひ皆様のご経験をご教示ください。

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