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(無題) 削除/引用 No.2705-11 - 2010/06/09 (水) 10:37:17 - in situ プラスミドをテンプレートにしたとしても、全長がtranscriptionされるわけではないですよね？ 目的のサイズはプラスミドのうちT7もしくはT3プロモーター以降の長さということになりますが、そこはあっていますか？ ホルムアミドに関しては、1ulとかボリュームが少ないと65℃10分で蒸発が怖いので、自分だったら5ulくらいにnuclease free waterでmess upして、それに等量のホルムアミドを加えて65℃10分→on ice、dyeを加えて泳動、という手順で行います。

(無題) 削除/引用 No.2705-10 - 2010/06/09 (水) 03:05:39 - あかね DIG-UTPは通常のUTPより分子量が大きいため、DIGがRNAに取り込まれると,RNA全体の分子量が大きくなり、電気泳動するとノンラベルのRNAよりもバンドが上にシフトすることがよくあります。また、DIGの取り込み率の違いによって、バンドがスメアになりがちです。

(無題) 削除/引用 No.2705-9 - 2010/06/09 (水) 01:23:03 - (-_-) 同様の実験をおこなっていて、一部のプローブについては２本バンドがでたことがあります。これらは、変性ゲルで流したら１本になりました。人生経験だと思って、一度変性ゲルで流してみても楽しいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2705-8 - 2010/06/08 (火) 23:13:44 - nissy ＞AP様 ありがとうございます。 非変性ゲルではどうしようもないようですね。 センスプローブも問題なくできてはいるのですが・・・。 当研究室では歴代こうしているらしく、悩みどころです。 ＞in situ様 ありがとうございます。 すいません、間違った内容でした。 プラスミドをテンプレートにし、DIG Labeling kitを用いて T3 or T7でin vitro transcription を行いゲルろ過精製しています。 目的サイズというのは、テンプレートのサイズに近いバンドという事で 正しいと思っていましたが違っていたのでしょうか・・・。 皆さん未変性ゲルで行ってきていたようです。 （先人に教わりました） 1ul プローブを泳動しているのですが、ここにホルムアミドを加え 65℃10分→on ice後にDyeを加え、流すということでよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2705-6 - 2010/06/08 (火) 22:52:28 - in situ 自分はT7とSP6しか使っていませんが、標識の有無に関わらず目的のバンド以外のバンドがでることがたまにあります、配列の中にプロモーターもしくはターミネーターの類似配列があるためではないかと推測していますが、確認はしていません。 ちなみに、テンプレートは何を使っていますか？ プラスミドを制限酵素処理でしょうか？ それとも、プロモーターを付加したプライマーでPCRする形でしょうか？ あと、非変性ゲルで流すとしても、流す前にホルムアミドを等量くらい加えて65℃10分→on iceで変性させるくらいはしたほうがよいとは思います。

(無題) 削除/引用 No.2705-5 - 2010/06/08 (火) 22:49:38 - AP >それよりもサイズの大きいところにバンドがでます。 可能性としては、 ・一本鎖RNAが複数、水素結合で会合している。 ・プラスミドがテンプレートの場合、線形化が完全ではなく（制限酵素消化が完全でない）run-throughした産物ができている。 ・伸長がスナップバックしてセンス鎖がつながっている。 三番目の場合は、ネガコンとしてセンス鎖プローブを作ろうとしたときにアンチセンス鎖もできてしまって困ることがあります。 いずれにしても、変性ゲルで泳動したりそれぞれのバンドは標識を持っているかどうかを調べることなしに、原因を追究したいというのは無理でしょう。

(無題) 削除/引用 No.2705-3 - 2010/06/08 (火) 22:25:10 - nissy ＞AP 様 ありがとうございます。 ご指摘のとおり、EtBrで染めて見ているだけです。 本来、非変性ゲルを使うべきではないと言われていますが、 できているかのチェックだけなので構わないと言われています。 非変性ゲルではできているかの判別はできないと 言うべきなのでしょうか？ 2本バンドがでてしまうのはDNase処理の有無には関係ないという ことなのでしょうか？ ちなみにほとんど全て２本バンドがでていますが、 in situ Hybridizationでは低バックで正しくシグナルは出ています。

(無題) 削除/引用 No.2705-2 - 2010/06/08 (火) 22:15:56 - AP 単にEtBrなどで染めて検出しているのではないでしょうね。 メンブレンにブロットしてanti-DIGで検出すれば、標識の入ったde novo産物か、未標識のテンプレートかは一目瞭然のはずです。 RNAプローブのような一本鎖核酸は、非変性ゲルでは二次構造をとりさまざまな移動度ととりえます。たとえば、ほぼ二次構造をとっていない状態のRNAプローブなら、同じ塩基長の二本鎖DNAとほぼ同じ移動度になるでしょう。それに対して、二次構造をとってファンデルワールス体積が小さくなったRNAプローブはそれより移動度が高くなります。そういうのが混在しているのではないでしょうか。ちゃんと鑑別したいなら、フォルムアルデヒドなどの変性ゲルを使う必要があります。

DIGラベルしたリボプローブの電気泳動 削除/引用 No.2705-1 - 2010/06/08 (火) 21:55:08 - nissy DIGラベルをし作製したリボプローブの電気泳動で質問です。 in vitro transcription後カラム精製を行い、 RocheのDIG Labeling Kitを使い、T3 or T7で反応、 DNase処理を行った後、ゲルろ過精製を行い、 リボプローブを作製しています。 その後、濃度測定と共に２％アガロースゲルで電気泳動を行い バンドの確認を行っています。 RocheではDNase処理はなくても大丈夫との事ですが、 当研究室でテンプレート量が多いのでするように言われ行っています。 泳動を行うと、DNase処理を行っているのに２本バンドがでます。 テンプレートと同じ位のサイズのバンドと、それよりもサイズの大きい ところにバンドがでます。 リボプローブを表しているバンドはテンプレートとサイズの近い バンドということでしょうか？（２本でる内のサイズの小さい方） DNase処理をしているのに２本バンドがでるのは、テンプレート量が 多すぎるからなのでしょうか？ 本当に初歩的な質問で申し訳ありませんが、ご教授ください。 よろしくお願いいたします。

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