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(無題) 削除/引用 No.2704-6 - 2010/06/09 (水) 19:41:41 - けん みなさま、親切なご回答ありがとうございました。 確かに相補鎖は形成しないようですね。ＤＮＡの図を見て納得することができました。本当にどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2704-5 - 2010/06/09 (水) 09:37:16 - ats > 突出末端が相補鎖になっているので、 ここが間違っていますね。 塩基の対合について教科書の図を眺めてください。

(無題) 削除/引用 No.2704-4 - 2010/06/08 (火) 23:06:42 - けん >[Re:2] APさんは書きました : > 冷静に考えてみてください。 > >この場合、切断によってできる突出末端が5'3'は逆ですが、同じ配列になっています。この場合、ライゲーション効率はかなり下がってしまうのでしょうか？ > と考える根拠は？　どういう事態を想定しているのですか？　それは合理的に起こりうると考えられることなんですか？ > ライゲーションはしませんが、突出末端が相補鎖になっているので、間違ったDNAが邪魔をして、正しいDNAが結合しにくくなるのではと思いました。 塩濃度に関しましては、Sac�Tを加えてインキュベートしてから、高塩濃度のバッファーとXho�Tを加えるという２段階の方法で行おうかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2704-3 - 2010/06/08 (火) 21:10:29 - ぶん Sac�TサイトにXho�Tサイトがくっついてしまわないか心配と言う事でしょうか？ でしたらくっつきようがないので、心配無用です。 このプライマーは一番端が制限酵素サイトではなく、サイトの外側に数塩基付けてありますか？ 一番端を制限酵素サイトにすると酵素によっては全く切れない事もあります。 詳しくはNEB（New England Biolabs）のカタログを見ると良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.2704-2 - 2010/06/08 (火) 21:09:19 - AP 冷静に考えてみてください。 >この場合、切断によってできる突出末端が5'3'は逆ですが、同じ配列になっています。この場合、ライゲーション効率はかなり下がってしまうのでしょうか？ と考える根拠は？　どういう事態を想定しているのですか？　それは合理的に起こりうると考えられることなんですか？ 注意点としては、プライマーの5'末端にいきなり制限酵素認識配列があっても切れない酵素がほとんどですから、さらに5'側に（一般的には）3塩基以上付加する必要があります。至適塩濃度がゼロのSacIと高塩濃度のXhoIは同時に切ろうとしても高効率は望めません。順番に切るようにすべきです。

制限酵素の切断について 削除/引用 No.2704-1 - 2010/06/08 (火) 20:28:46 - けん こんにちは。 早速質問ですが、プライマーの設計をしていて、Sac�TとXho�Tの制限酵素サイトを付加させようと思いました。 Sac�T　　　ＧＡＧＣＴ：Ｃ 　　　　　 Ｃ：ＴＣＧＡＧ Xho�T　　　Ｃ：ＴＣＧＡＧ 　　　　　 ＧＡＧＣＴ：Ｃ　　　 以上が切断認識サイトで、：が切断される部分になります。 この場合、切断によってできる突出末端が5'3'は逆ですが、同じ配列になっています。この場合、ライゲーション効率はかなり下がってしまうのでしょうか？ 他のマルチクローニングサイトにある制限酵素は使いにくいものしかありません。付着末端になってしまうもので・・・ ぜひ教えてください。よろしくお願いします。

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