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(無題) 削除/引用 No.2697-92 - 2010/06/15 (火) 11:09:04 - in situ >パイプ椅子さん 参考文献を挙げていただき、ありがとうございます。 今までいくつかの研究室を経てきていますが、おはずかしながらエアロゾルに関しての話がでてきたことはありませんでした。 フィルターチップをPCRで使っている人も見たことがありません… エアロゾルによるコンタミを含め、今後はPCRに関する認識を改めようと思います。 スレの本筋と話がずれて恐縮ですが、ここでお礼をさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2697-91 - 2010/06/15 (火) 09:03:56 - うーん・・・ そもそも、PCRの経験者がまったくいなくて、生物系、医学系、生化学系の研究室ではなくて、PCRマシンがある研究室って、どんなところなんでしょう？？？ とりあえず、近くの研究室とかで、PCRやジェノタイピングについてやっていそうなところを、上司に紹介してもらってはどうですか？ 全員が素人の研究室で素人（ゴメンナサイ、素人補佐員とあったので）が出しだデータが、信用に足りる物だと、誰が保証できるのでしょうか？ 私が上司だったら、信用のできるデータが取れるよう、どこかで修行してきてもらいますけど････。

(無題) 削除/引用 No.2697-90 - 2010/06/14 (月) 19:33:05 - レフト キットを使わない方法、日本語のサイトもありました（後者は関連箇所が英語ですが）。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/archives/2009/04/kod_fx_15.html http://square.umin.ac.jp/biochem2/contents/Manuals/manual84.html

(無題) 削除/引用 No.2697-89 - 2010/06/14 (月) 19:20:04 - レフト アルカリを使う方法は多数のサンプルをこなすための簡便法です。アルカリを嫌うなら、手数は掛かりますがもう少し真面目にDNAを調整する方法はいくつもあります。フェノール（フェノール・クロロホルム）処理を含むプロトコルは、よりきれいなDNAが取れますがアルカリ並みには危険です。そこを飛ばしたプロトコルもネットにいくつも転がっています。例えば次。 http://stanxterm.aecom.yu.edu/wiki/index.php?page=Tail_DNA_extraction_-_simpler_method

(無題) 削除/引用 No.2697-88 - 2010/06/14 (月) 19:16:52 - ~ >アルカリ処理をする場合の注意事項と対策 NaOHのMSDSをそのまま引用できませんかね。 スルーされていましたが、#25で引用した http://cse.fra.affrc.go.jp/ksaitoh/extractDNA.html はアルカリは使っていません。 フェノクロは使いますし、そちらのほうが危ないですが。 試薬やキットを買うのが駄目で、アルカリやフェノクロが使えないというのであれば、 はっきりと「自分には出来ないからやれる系を提示するように」と言ってはいかがでしょうか。 アーサー・コーンバーグ博士の10か条の1つ You can't purify enzymes with toothpicks. を教えてあげましょう。 http://www.naramed-u.ac.jp/~bioch/Medical081105.pdf

もらうなら 削除/引用 No.2697-87 - 2010/06/14 (月) 19:10:21 - *** マウスのgenomeDNAぐらい持っている人がいるような気がしますが。

困ったときの・・・ 削除/引用 No.2697-86 - 2010/06/14 (月) 18:01:34 - 名無し >アルカリ処理ですが、危険なのでやらないで欲しいと先生に言われました。 皆様が示されたプロトコールにある0.1N NaOHが危険というのが、どうにも理解できないのですが・・・（0.1N なら、既に劇薬ですらない濃度ですし） それはともかく、”通りすがりの名無し様”の指摘通りキットを使うしかないですね。しかも”ophites”様のいう通りボスの財布の紐が堅そうなので、メーカーさんに泣きついて試供品を貰うのが吉です。困った時のメーカー頼りですね。 各社のユーザーサポートに電話して、試供品が貰えないか聞いてみましょう。また、出入りの業者に相談しましょう。ついでにフィルターチップや最新のTaqなどもおねだりしてみては・・・？「今は試しですが、うまくいったらたくさん使います」というふいんきを醸し出すのがコツです。上得意になるかも？ということですね。 もっと手っ取り早いのは、生化学会とか大きな学会の展示場に行って、サンプルをゲットすることです。これはお手軽。

ゲノム抽出キットなら 削除/引用 No.2697-85 - 2010/06/14 (月) 17:40:12 - ophites 以前、あちこちの見積もりを取った際、シグマアルドリッチのGenelute mammalian genomic DNA extraction kitが一番安かったように記憶しています。 (けっこう前の事なので、今はもっと安いものもあるかもしれませんが） しかしそれでもそこそこ高いものなので、新しいTaqを買うのを拒否する先生が購入を承諾してくださる可能性は低いような気がします。 余談ですが、私は技術補佐員なんて雇うのはよほどお金持ちの研究室で、通常は学生をめいっぱい働かせるものだと思っていましたが、そうでもないのですね。

(無題) 削除/引用 No.2697-84 - 2010/06/14 (月) 17:22:50 - 通りすがりの名無し ゲノム抽出キットの使用を検討してみてはどうでしょうか？ 血液から取るキット、組織から取るキット・・・様々あります。 タカラバイオ、インビトロジェン、バイオラッド、キアゲンあたりに電話してカタログ貰ってみるといいと思います。 （もしくはここの諸先生方、お勧めありますか？）

(無題) 削除/引用 No.2697-83 - 2010/06/14 (月) 17:07:14 - あんこ アルカリ処理ですが、危険なのでやらないで欲しいと先生に言われました。 私は実験をする前に全て報告する義務があるので黙って行えませんでした。 先生に立ち会っていただいて実験したいと提案しましたが、専門外だから無理だと断られ、アルカリ処理をする場合の注意事項と対策を提出することになりました。 正直、限界を感じます。 ザンギ様 タイムリーなアドバイスありがとうございました。 調べてレポートを書きます。

アルカリだけじゃなくて 削除/引用 No.2697-82 - 2010/06/14 (月) 16:05:59 - ザンギ 危険な試薬は目に入ると失明する恐れがあるので、扱うときは必ず防護メガネ をする。皮膚につくのもよくないので実験着を着てラテックス手袋などをする。 アルカリは皮膚などについても刺激が強くないので油断しがちですが、十分 注意してください。 NaOHなどのアルカリは目に入ると特に危険なので、そういう注意があったのかと 思います。 それ以外の場合でも実験作業時には自身を防護するのが望ましいです。

(無題) 削除/引用 No.2697-81 - 2010/06/14 (月) 10:21:14 - あんこ URLありがとうございました。 雑用が終わったら読んでみます。 ちなみに私はバイオ以外の工学部を卒業した女です。 バイトの条件が学歴大卒(学部不問、文系でも可能)、未経験者OKの40歳未満でした。 面接でも全てお話しましたが採用していただけました。 毎日少しづつですが解ってきました。 今日も頑張ってみます。 レスをくださった皆様のおかげです。 また結果を報告します。

(無題) 削除/引用 No.2697-80 - 2010/06/12 (土) 18:38:22 - *** 生物以外の理系大学を卒業してパートで生物系実験の補助している男だったのか。厳しい世の中ですよね。

ロシュの出してるPCRガイド 削除/引用 No.2697-79 - 2010/06/11 (金) 22:36:07 - パイプ椅子 http://roche-biochem.jp/prima/prima_molecular_biology/pcr_j/index.html ロシュの出してるPCRガイドだよ。 エアロゾルなんてシラねって逝ってる研究初心者さんも読んでねｗｗ あと、みんなアンコさんを♀だと思ってるかも知れないけど、違うと思うよｗ

余計なことかもしれませんが 削除/引用 No.2697-78 - 2010/06/11 (金) 19:14:04 - ちろる 結局PCRは今日やり直してないんでしょうか。 サービス残業しないとおっしゃっていたのでもぅ見てらっしゃらないかも しれませんが。 それと、上司があまり理解のある方ではないようなので、こちらで皆さんが出されるご提案などを、すぐに上司にぽんぽん意見するのはあまり良い策とは言えないような…。 しばらくがんばるにせよ、そのうちやめられるにせよ、まずは傍目にアピールできるようになにかと手作業なり分子生物学の知識を少し仕入れるなりなさったほうが、将来的には有利かもしれませんよ。 作業にあたって気をつける点多々ありますが、まずはやり直しちゃってなんらかの結果（バンドが出ても出なくても）があるほうが、そういう上司とは話が通しやすい気がします。あくまで印象ですが。

(無題) 削除/引用 No.2697-77 - 2010/06/11 (金) 18:16:52 - ？ とりあえず質問者がちゃんと勉強する、これがまず最初かと。 いくら教えたがりが色々言っても通じてないんじゃしょうがない。

コンタミについて 削除/引用 No.2697-76 - 2010/06/11 (金) 15:28:41 - 名無し' PCRのコンタミについてですが、プライマーの汚染については羊土社の「本当に増えるPCR」に記載があります（月並みですが）。尤も、プライマーよりTaqのコンタミのほうが被害額が大きいと思います。 質問者さんがコンタミに留意すべきと思う理由は三点あります。 １．もし研究が「バンドの有無＝実験結果」のような内容であれば、偽陽性は非常に困る（プラスミドを鋳型としてのPCRとかなら、多少のコンタミは平気ですが） ２．普通のラボなら、万一コンタミしても同僚にTaqを借用できるが、質問者さんはいけずな？ボスに頭を下げて酵素を買い直すハメになる ３．同じく普通のラボなら、PCR反応液調製用のピペットマンと反応後のピペットマンを別に出来るが、お金をケチっていそうな質問者さんのラボでは、一本のピペットマンを全用途に用いている可能性が高い という理由です。なお、エアロゾルといっても室内に浮遊しているものではなく、ピペットマンから吐出されるものが最も危険です。その意味ではクリーンベンチの使用はやり過ぎと思います。オートクレーブは過去ログに何回か出てきたと記憶していますが、PCRのコンタミに関しては逆効果の可能性が高いと思います。 長くなりましたが、質問者さんにご意見するとすれば「業者さんに泣きついてフィルター付きチップの試供品を貰いましょう」です。PCR反応液の調製時にそれを用いるだけで、コンタミの危険性は大幅に減ります。

(無題) 削除/引用 No.2697-75 - 2010/06/11 (金) 15:00:55 - あんこ 皆様には大変お世話になっております。 初めて聞く単語ばかりで会話についていけません。 高温の確認は蓋の上から手で触ってみました。 試薬は少しづつ分けて(分注？)してしまいました。 オートクレーブは、うちには無いそうです。 PCRの小さな入れ物は紙の箱に入っていて、取り出してそのまま使っています。 チップは使い捨てで毎回変えています。 50mMNaOHはある程度の量を作ってしまいました。pHが下がるなら破棄したほうがいいですか？ アルカリ処理をしなければならない具体的な理由と理論を説明しろと言われ出来ませんでした。 アルカリは危険なので事故に注意しなさいと教えていただきましたが注意の仕方がわかりません。 あとはオートクレーブの装置はいくらくらいするのでしょうか？ 安いものなら買ってもいいそうです。

(無題) 削除/引用 No.2697-74 - 2010/06/11 (金) 13:31:08 - in situ 自分もPCR試薬を分注して保存とかはしていません。 酵素類は使用時に温まって失活したりするリスクを分散するために、元ストックを何本かに分注したりはしています。 チップに関しては、オートクレーブが汚染されてて汚い液をかぶったチップが汚染したという話は聞いたことがありますが、分子生物が専門でないラボならオートクレーブそのものがなくて滅菌済みのチップを購入されていたりするのではないでしょうか。 エアロゾルによるコンタミっていうのは初耳なんです。それが本当なら操作を全部クリーンベンチ内で行う必要が出てくると思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.2697-73 - 2010/06/11 (金) 13:08:58 - それは >名無しさん それはちょっと神経質になりすぎでは？

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