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(無題) 削除/引用 No.2697-10 - 2010/06/08 (火) 15:48:10 - Pumpkin >教授に相談もしましたが君に任せる結果だけもってこいと言われ困っています。 ザンギさんのご指摘にあるように、ちょっと言い過ぎてしまったかもしれません。あまりお気になさらずにしてください。 >教授に相談もしましたが君に任せる結果だけもってこいと言われ困っています。 パートタイムということでモチベーションの問題もありますが、期待してもらっているということにして奮起してがんばってください。 ただ、やっぱり勉強するしかないと思うので、教えてもらえる人が割合近くにいれば教えてもらう。だめなら実験書を参考にしてネガコン、ポジコンをしっかりと入れていくことで実験をきちんと評価していくという姿勢が必要だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2697-9 - 2010/06/08 (火) 15:31:36 - とおりすがりのななし 同一施設に分子生物学的な研究室があれば事情を話して Total cDNAとプライマー（GAPDHやactin）を一回分、分けてもらってはいかがでしょうか。 酵素や試薬の失活ならこれで判明すると思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-8 - 2010/06/08 (火) 15:03:53 - あんこ ありがとうございます。 エチブロは毎回新鮮なものを直接ゲルに入れています。 保存は遮光して冷蔵庫にしまっています。 ある日突然バンドが出ないのは私も始めてで困っています。 今、プライマーを新しくして再挑戦しています。 後ほど結果を報告させていただきます。 余談になりますが、一番上の先生に私一人ではどうにもならないと訴えたのですが、どうにかするしかないと取り合ってもらえません。 技術補佐員って誰かの指導の元に作業を行う立場だと思っていました。 完全に独立して実験を進めるのが補佐員なんですか？

(無題) 削除/引用 No.2697-7 - 2010/06/08 (火) 14:18:00 - あべちゃん > 私もラボに入ってから生物系が出来る先生がいない事を知り驚いています。 > 教授に相談もしましたが君に任せる結果だけもってこいと言われ困っています。 > 私はただのパートなのに･･･。 それは大変ですね。 以前確認されていたサンプルを用いても検出されないと言うことは、何かがへたっていると考えられます。 すでに指摘されている以外で考えられるのは、検出に使っているEtBrなどですかね。 急に全く見えなくなることは少ないと思いますが、光にさらされているとだんだんへたっていきます。

(無題) 削除/引用 No.2697-6 - 2010/06/08 (火) 13:56:15 - あんこ 皆様ありがとうございます。 私もラボに入ってから生物系が出来る先生がいない事を知り驚いています。 教授に相談もしましたが君に任せる結果だけもってこいと言われ困っています。 私はただのパートなのに･･･。 PCR溶液の量と新鮮なプライマーを用いて再度実験してみます。

(無題) 削除/引用 No.2697-5 - 2010/06/08 (火) 00:36:02 - ザンギ 技術補佐といってもいろんなスキルのレベルがあるので、一概にこうあるべきと 言うのは難しいと思います。 PCRプライマーは何十回も凍結融解すると劣化するので、希釈したら4度保存で 1週間くらいの使い切りがいいです。 元の濃い液（普通は100マイクロM）がTEバッファー溶液なら暗所の4度でほぼ 永久に保存できます。 組織試料を直接PCRにかける実験は自分は経験がありませんが、多すぎるとよく ないと思います。マウスの尻尾なら組織の大きさあたりに含まれるDNA量は ある程度一定の範囲内に収まると思うので、うまくいってた時の大きさになる べく揃えて実験してみてください。 酵素やｄＮＴＰなども劣化することはありますが、まずはこの2点から疑うのが 普通かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-4 - 2010/06/07 (月) 22:06:21 - Pumpkin これは、この掲示板でどうにかなるような問題でなくて、しっかりと実学で勉強する必要があると思います。あなたが技術補佐（テクニシャン？）としての地位にいるとしたら、やはりそれ相当の技術を身に着けていてしかるべきではないのでしょうか。技術補佐といいながら、ラボにだれもPCR経験者がいないとはいったい何を補佐しているのでしょうか（私が名前に釣られているだけならまだいいのですが）。唯一アドバイスできるとすれば、 >生体組織が大きすぎたらバンドが出ないとか、小さかったらバンドが出るとか ダイレクトPCRの場合、投入するサンプルにはPCRを阻害する不純物が沢山含まれているわけで、当然そのように考えられます。大腸菌のコロニーPCRですら、多めにコロニーを取るとPCRがかからないことがままあります。PCRの反応液が少なければ少ないほど不純物の影響を受けるわけですから、20uLというのはやはり小さな系といえるでしょうね、ダイレクトPCRにおいては。

(無題) 削除/引用 No.2697-3 - 2010/06/07 (月) 21:39:40 - あんこ 早速のレスありがとうございます。本当に素人ですみません。 言葉の意味すら判らないのですが、わかる範囲でお伝えさせていただきます。 >テンプレートゲノムですか？cDNAですか？ マウスの生体を切って直接PCRにかけています。 >プライマーはどうやって保存していますか？ 冷凍庫で保存しています。 プライマーの濃度が薄い可能性もありますよね？？？ >PCRはどのような条件でやっていますか？ 98度5分→98度5秒→60度5秒→72度20秒→72度1分→4度∞　です。 以前はこの条件でバンドがハッキリと出ていたのですが、条件を一切変えていないのに突如でなくなりました。 PCR溶液(dNTP＋PCRバッファ+プライマーetc)の容量が少ないのも問題では無いか？と思ったりもしています。 例えばPCR溶液20µLに対して生体組織が大きすぎたらバンドが出ないとか、小さかったらバンドが出るとか、そのようなことは無いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2697-2 - 2010/06/07 (月) 21:22:37 - ぶん もうちょっと情報がないと答えづらいと思います。 テンプレートは何を使っていますか？ ゲノムですか？cDNAですか？ どのように保存していますか？ プライマーはどうやって保存していますか？ PCRはどのような条件でやっていますか？

PCRで突如バンドが出なくなりました 削除/引用 No.2697-1 - 2010/06/07 (月) 20:10:13 - あんこ 素人技術補佐員です。 タイトルのとおりにPCRで突如バンドが出なくなりました。 条件は一切変えていません。 以前にバンドが出たサンプルを用いてPCRしてもバンドが出ませんでした。 酵素が分解されていると解釈してよろしいでしょうか？ 研究室に誰一人としてPCR経験者がいなくて四苦八苦しています。 素人質問でお恥ずかしいのですが、先輩諸先生からのお力を拝借させてください。 よろしくお願いします。

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