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(無題) 削除/引用 No.2697-32 - 2010/06/09 (水) 12:25:12 - NF 一つお伺いしたいのですが、 以前バンドが出たサンプルと今回使っているサンプルは同じマウスからのものでしょうか？ 例えば、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスのジェノタイピンを行っているのであれば、マウスの取り違えで、今回はハズレ（バンドが出ない）のマウスを使ってることはありませんか？

落ち着いて 削除/引用 No.2697-31 - 2010/06/09 (水) 11:48:06 - ちょこ 尻尾の先端を切ってPCR溶液に直接入れて反応させているのであれば、うまく行く可能性の方が低いように思われます。 今日中に結果を出す必要があるならば、アルカリ溶液中で高温にして尻尾を溶かし、適当なバッファで薄めてから遠心して固形物を沈め、上澄みをPCRするとよいと思います。ポリメラーゼは、TaqよりKOD FXの方が上手く行きやすいと思います。古くてもKOD FXは多分大丈夫です。 サイクルが40というのは、目的の位置よりも高分子側にスメア上のバンドが出るようなPCR条件だと思います。 それから、プライマーと標的の配列から予想されるPCR産物の長さを把握していますか？ また、電気泳動の際に、核酸の長さの指標になるものを入れていますか？例えば、1kbpラダーとか。

(無題) 削除/引用 No.2697-30 - 2010/06/09 (水) 11:32:46 - みみ 先生が痛い人だけど立場上何も言えないという辛いパターンな気がします。 普通に考えたらゲノムの抽出キットを使うところだと思うんですが。 適当に組織を放り込んで安定した結果を出せとか無理...。

(無題) 削除/引用 No.2697-29 - 2010/06/09 (水) 11:29:50 - あんこ また補足です。 何度もすみません。頭がパニック状態です。 >使用しているTaqの添付文章の推奨プロトコールですか？ はいそうです。 全く変更せずにPCRしています。

(無題) 削除/引用 No.2697-28 - 2010/06/09 (水) 11:27:58 - fish もっと細かく条件を書かないと皆さんアドバイスしにくいと思いますよ。 シッポ~~mmをeppenにいれ、^^を^^ulいれる。 95℃ 1hrs bufferを^^ul入れて、Tris-HClを^^ul入れて中和。 15000gX15min supを1ul templateにして、total (ul)の系で taqは--を用いて、^^の条件でかけると目的の^^bpのバンドが一本検出 など

(無題) 削除/引用 No.2697-27 - 2010/06/09 (水) 11:08:16 - あんこ 先生に「混ぜるだけな誰にでも出来る簡単な作業なのに、まだ出来ないの？今日中に結果出せる？」と叱られました。 パートな身分だと訴えましたが「技術補佐員でも論文を書いてもいい」と言われました。 論文なんか卒論しか書いたことありません。 指示されたプライマーは、行き帰り？1種類づつです。 マウスの尻尾は2ミリくらい切っていました。 血液の時は紙にジワーと染込んで3ミリくらいの円にしていました。 尾はみじん切りにしていませんでした。 サイクル数を減らしてやってみます。 それと東洋紡のKOD FXが冷凍庫に入っていたので試してみます。 KOD FXはいつ誰が購入したのか解らないそうです。もう4年くらい前からの物らしいですが大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.2697-26 - 2010/06/09 (水) 10:54:17 - nanasitaro >尾っぽから採血して紙に吸収させてやってみたり、尻尾そのものをPCRにかけたりしてみました。 採血は最初からバンドが出ませんでしたが尻尾から直接やったときにはくっきりハッキリバンドが出ました。それも何回か。なのにある日突然バンドが出なくなりました。 突然でなくなるまでは、何サンプル実験を行い、何回成功したのでしょうか。 「出ないことが正解」という可能性があるかもしれません。 指示されたプライマーは何種類あるのですか？ あと、面倒かもしれませんが、ゲノムの精製を提案してみては？ >PCRは98度5分→98度5秒→60度5秒→72度20秒→72度1分→4度∞ 使用しているTaqの添付文章の推奨プロトコールですか？

(無題) 削除/引用 No.2697-25 - 2010/06/09 (水) 10:52:39 - ~ 出典が2chなので、このプロトコルをそのままやるには上司への説明が困りますが、 尻尾からのゲノミックPCRは下記の操作くらいは手間をかけてやられているものです。 尻尾を放り込んで行なうのは、安定しないと思います。 50 ：現在ノックインマウス作成中：04/03/12 23:48 丁寧タイピング 1)しっぽを lysis buffer(TrisHcl 10mM,Nacl 150mM,EDTA 10mM)＋ProK処理 65℃ overnightで なるべく振とうする 2)遠心して不純物を落としたあと、上澄みをフェノクロ(以下室温で操作する） 3)0.7等量の2-propanolを加えて、イソ沈そのあと70%EtOHでリンス 4)5minほどドライアップして、TEなどに溶かす。65℃1hrとかO/Nとかvortexとかしてよく溶かす。 5)定量してtemplateに0.1ugほど使う。 ＊溶かしが甘いとバンドが出にくい。操作は室温の方がいいみたい。 定量はめんどいんで、１サンプルだけやればいいでしょう。 タイピングPCRではtemplate量はそんなにそろえなくても大丈夫。 ＊これでもバンドが出にくいなら、プライマーを変えた方が良い。 51 ：その２：04/03/12 23:52 速攻ジェノタイピング 1)しっぽに0.1% SDS,0.1N NaOH を100ulとH2Oを50ulぐらい入れる。 2)98℃、15min 3)TEを300ulぐらいいいれる。 4)1ulをtemplateに使ってPCR *遺伝子やプライマーによってかかりにくい。 *速さ重視ならTakara Z-Taq、 丁寧タイピングでも速攻タイピングでも お勧めはeppendorf HotMaster Taq や Takara-Extaq HS(Hot Start)など。 特にHot Start系の酵素の方がgenomic PCRはかかりやすい。 こちらならば、論文の出典が書かれているので、上司に見せやすいでしょう。 材料がサカナですけど、少なくとも哺乳類培養細胞から、この方法でゲノミックPCR用のDNAは取れました。 http://cse.fra.affrc.go.jp/ksaitoh/extractDNA.html

(無題) 削除/引用 No.2697-24 - 2010/06/09 (水) 10:48:25 - ~ PCRチューブに20uLのPCR mixが入っていて、そこに尻尾が突っ込まれているのでしょうか？ マウスのジェノタイピング用に様々なゲノムDNA調整法、キットが出ているのに、 それで増えるのでしたら、その方法を発表して欲しいと思います。 根拠はありませんが、 >サイクル数は40で の部分が今回の原因だと思います。 このサイクル数は多すぎると思います。 これだけ回せば、非特異に増えてくるものが出てきてもおかしくはないでしょう。 そのサイクル数でないとバンドが出ないのならば、 私ならば非特異やPCRを阻害する物質のコンタミを疑います。 >尻尾から直接やったときにはくっきりハッキリバンドが出ました。 尻尾はどの位入れているのでしょうか？ みじん切りにしていますか？ 尻尾をそのまま入れているのであれば、切断面から出てきたDNAしかテンプレートにならないので、系自体がおかしいような気がします。 サイクル数40で出てきたartifactに惑わされているような気がします。 >72度20秒は少ないでしょうか？ 私ならば30秒にしてみますが、問題なく増えているのでしたらここが問題ではないのでしょう。 >全く無関係な学部で半泣きです。 学部卒であれば、関係ある学部でもそのトラブルシューティングは難しいと思います。 PCRの系を立ち上げるところからやり直した方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-23 - 2010/06/09 (水) 10:35:00 - Pumpkin >組織試料を直接PCR これは、ダイレクトPCRですよね。核酸精製せずにPCRかけているんだと思いますが、例えばマウステールをすりつぶした内の上清いくらかをPCRに持ち込むのが一般的だと思います。やはりみなさんがいうように組織丸のままをPCR反応液に入れて、プログラムを走らせているとしたら不純物が多すぎるでしょう。 糸状菌の菌糸なんかをダイレクトにPCRすることがありますが、これは菌種によって走ったり、走らなかったりします。 会社を限定してリンクはって申し訳ありませんが、なにか参考になるのではないでしょうか。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/archives/2008/05/post_38.html

(無題) 削除/引用 No.2697-22 - 2010/06/09 (水) 10:34:25 - あんこ 補足です。 泳動するとゲルの上の方からダーーっと全体に渡り薄い尾を引いたようなバンド？が出ます。 これは打開につながる情報でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2697-21 - 2010/06/09 (水) 10:27:05 - あんこ ブルーになりながら出勤してゴミ捨てや掃除などの雑用をして今から実験に取り掛かります。 PCR産物はややこしいのでバンドを確認したら毎回破棄するよう指示されていて残っていません。 尾っぽから採血して紙に吸収させてやってみたり、尻尾そのものをPCRにかけたりしてみました。 採血は最初からバンドが出ませんでしたが尻尾から直接やったときにはくっきりハッキリバンドが出ました。それも何回か。なのにある日突然バンドが出なくなりました。 サイクル数は40でバンドは400くらいです。 72度20秒は少ないでしょうか？ こうやって教えていただいていると本当に私に知識が無いなと思います。 一応、理系の大学は出ましたが全く無関係な学部で半泣きです。 丁寧に指導するうえに完全なお手伝い業務だと面接で言われましたが嘘偽りでした。 が、愚痴っても仕方ないので私のスキルアップのためにも頑張ります。 皆様の応援が励みになっています。 ずぶの素人ですがまた色々と教えてください。 とりあえず今から昨日失敗したサンプルを100倍に希釈してPCRしてみます。 その間にポジコンを探してみます。

(無題) 削除/引用 No.2697-20 - 2010/06/09 (水) 09:40:17 - ~ >ザンギさん 血液をテンプレートにしたゲノミックPCRであれば、聞いたことがあります。 ただ、 >マウスの生体を切って直接PCRにかけています。 という表現が血液を意味しているのかは疑問です。 （尻尾を”切って”採血していると言っている？） テンプレートは間違いなく今回のトラブルの原因候補の筆頭のはずなのに、 特定されるのが嫌でいえないのですかね。

(無題) 削除/引用 No.2697-19 - 2010/06/09 (水) 00:29:49 - ザンギ 同じような状況に置かれてる方は、意外と他にも沢山いると思います。 上司から厳しすぎることを言われても腐らないで頑張ってください。 一つだけ気になったので、どなたか教えてください。 僕は組織試料を直接PCRにかけたことがないのですが、これって一般的な 方法でしょうか。ゲノムPCRでしょうか？それともRT-PCR？

(無題) 削除/引用 No.2697-16 - 2010/06/08 (火) 20:15:47 - 名無し >上の先生に試薬を購入しなおしてもらいたいと伝えると予算が無いから >無理だ、以前バンドが出たなら絶対できるはず早く結果を持ってきてと >言われてしまいました。 まあ、PCRが走らなくてがっかりするお気持ちはわかりますが、Taqは高い ので仕方ない反応と思います。私の部屋も貧乏なので・・・ 今のTaqは性能が良いので、そう簡単に失活するとも思えません。"とおり すがりのななしさん"の指摘通り、確実に増えるPCRを行ってTaqの生き死に をはっきりさせてから、先生に掛け合うのが常道と思います。 total cDNAが無いなら、以前回収したPCR産物を大幅に希釈して再PCRすれば たぶん出ますし、pUC系のプラスミドがあれば、M13系のありふれたプライマー でマルチクローニングサイトを増やしてみればいいでしょう。それでも 全く増えないなら、本当にTaqが死んでるか、何か根本的な異常があります 私としては、ザンギさんの「組織多すぎ」に一票です。組織を直接突っ込む PCRは、結構難易度高い（運に左右される時もある）と思いますよ

(無題) 削除/引用 No.2697-15 - 2010/06/08 (火) 20:14:29 - ぶん マウスの生体を直接PCRしているとの事ですが その生体は毎回新しい物ですか？前にバンドが出た時に使用した物ですか？ もし、前の物でしたらどうやって保存していますか？ PCRは98度5分→98度5秒→60度5秒→72度20秒→72度1分→4度∞ とのことですが、サイクル数はいくつまわしていますか？ （98度5秒→60度5秒→72度20秒のところを何度か繰り返してると思いますが その回数は？） また、出てくるはずのバンドのサイズはどれくらいですか？ サイズによっては72度20秒は短すぎるのでは？と思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.2697-14 - 2010/06/08 (火) 20:09:23 - ぶん PCR産物が残っているのでしたら、100倍程度に薄めて（1ulを99ulのTEに溶かす） 1ulをテンプレートにすれば掛かるはずです。 もし、これで掛からなければ試薬を疑った方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-13 - 2010/06/08 (火) 20:08:02 - ？？？ まずは出入りの試薬屋さんに、近所の研究室の状況を聞いてみて、相談先を選定したら良いのでは。 もし、教授が暗黒面に墜ちていて、確信犯で「君に任せる」と言っているのでなければ、何とかなりますよ。

(無題) 削除/引用 No.2697-12 - 2010/06/08 (火) 19:02:53 - あんこ やり直しましたがやはりバンドは出ませんでした。 上の先生に試薬を購入しなおしてもらいたいと伝えると予算が無いから無理だ、以前バンドが出たなら絶対できるはず早く結果を持ってきてと言われてしまいました。 プライマーの設計は最初から指定されていたので恐らく合っています。 不思議で仕方ありません。 身近に分子生物学を気軽に聞ける方は全くいません。 共同研究されている方は皆さん生物系では無いそうです。 じゃ何故にPCRが必要なんだ！？ 私を研究者と思っているのでしょうか。本当に困ります。 PCRをかけてバンドが出た産物を更にPCRかけるとバンドは出ますか？

(無題) 削除/引用 No.2697-11 - 2010/06/08 (火) 17:03:11 - ？？？ 教授やラボスタッフが生物系でないとすると、実験計画自体がおかしい可能性もありますね。プライマーの設計を間違えていたり、、、以前に検出できていたＰＣＲバンドが、コンタミ由来のお化け（アーティファクト）だったり。 結果が出ればＯＫとのことですので、怪しい試薬・酵素は全て更新し、ポジティブコントロールの鋳型ＤＮＡ、プライマーセットも購入してもらいましょう。また他の方も、アドバイスされているように、近所もしくは教授の共同研究者で、分子生物学の心得のある人を見つけましょう。これを乗り越えれば、目に見えて自力が付くはずですし、ラボで唯一生物実験をこなせるメンバーということで重宝されるはずです。がんばって下さい。

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