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(無題) 削除/引用 No.2697-52 - 2010/06/09 (水) 19:39:59 - あんこ 123様 すれ違ってすみません。 投稿したら123様のレスがUPされました。 明日頑張ってみます。 パートはパートですが2年間は辞めるなとおっしゃるので、もう少し頑張ってみます。

(無題) 削除/引用 No.2697-51 - 2010/06/09 (水) 19:24:57 - あんこ 本当に本当に皆様ありがとうございます。 業務時間は5時までですがサービス残業しています。 お手本を見せて欲しいとは一番最初にお願いしましたが、専門が違うから出来ない。手本が必要なら他のラボの誰かに習ってきて。と言われ、 来たばかりで友達もいないし他のどのラボがPCRしてるのかも知らないし自力で勉強しました。 そもそも理系だったら何でも出来るって考えているのが間違いです。 ご自分は専門が違うから出来ないって言うのに変なの。 PCRの時にテンプレートなしは作っていませんでした。 作ってみます。 20マイクロリットルに1ミリにしてみます。 明日、アルカリ処理してタカラのtaqでPCRしてみます。 そのときのプロトコルは 95度5分 95度30秒→60度30秒→72度1分　を30サイクル 72度1分 4度∞ でよろしいでしょうか？？？

まとめると 削除/引用 No.2697-50 - 2010/06/09 (水) 19:17:39 - 123 Tris-HCl pH8.0を作ったのなら No37より １）尾の先を2mm前後カット。 ２）50mM NaOH溶液180uLを加え、95℃,10分加熱。 　完全に溶解しないがが、問題なし。 ３）1M Tris-HCl, pH8.0を20uL加えて中和。 ４）12000rpm, 10min遠心し、上清1uLをテンプレートとして使用。 ■PCR　mix 大丈夫？ DNA 　　　　　uL FW primer uL　( uM) RV primer uL ( uM) dNTP uL ( mM) 10xbuffer 2.0uL rTaq 0.2uL H2O uL ----------------------- total 20uL No37より 95度5分 95度 30秒 | 60度 30秒 |を30サイクル 72度1分　 | 72度1分 4度∞ 10uL 電気泳動 1.2%　agarose gel 30min 観察

(無題) 削除/引用 No.2697-49 - 2010/06/09 (水) 19:11:17 - mom-a >ポジコンとネガコンは無いそうです。 >次にバンドが出たサンプルをポジコンにするように言われました。 PCRの時にテンプレートなしを1本つくっていますか？ 今までなかったら、必ず1本入れて下さい。時として水しか入れていないのにバンドが出ることがあります。「良く」あっては困るのですが、慣れていない人がやったり、コンタミしやすい環境で実験していたりするとよくあります。

(無題) 削除/引用 No.2697-48 - 2010/06/09 (水) 19:09:12 - レフト 何度もすみません。 バンドの出なかった2 mmの尻尾、PCR反応溶液に浸かって加温されただけですから、これをアルカリ処理してDNAを回収して問題ないと思いますよ。私には使えない理由が分かりません。 また、下の人に理由を訊かれて「常識だから」と答えるような人の言うことは私は信じられません。

(無題) 削除/引用 No.2697-47 - 2010/06/09 (水) 19:07:16 - ~ >すぐに辞められたら研究室の評判にも関わるので2年は続けて欲しいそうです。 相手の方から言わせたのですから、2年間のんびりしたらいいのでは？ 仕事ができないと言う人を引き止める以上は、 仕事をしなくてもいいから、2年間在籍して欲しいということですよね。

(無題) 削除/引用 No.2697-46 - 2010/06/09 (水) 19:03:08 - レフト コメントが沢山付いて却って混乱させていたらすみません。 以前のあんこさんのコメントを読んでいたら、20 microLのPCR反応溶液に2 mmの尻尾を入れてPCRをしているように読めたのですが、それで間違いないでしょうか。だとしたら、いくら何でも尻尾入れすぎです。アルカリ処理等で抽出したDNAを1/10容程度使うだけにした方が良いでしょう。 小学生にも出来ると言うならまずはお手本を見せてくれ、と言ってみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.2697-45 - 2010/06/09 (水) 18:38:30 - ああああ 一度、辞めたいと伝えたのであれば、もう関係性を気にする必要はあまり無いですよね？ 分子生物をかじったこともないのに、PCRなんか小学生でもできるとはずいぶんな言い方ですね。そりゃあ、まともなテンプレート、プライマーがあれば混ぜるだけだから小学生にでもできるかもしれないけど… 小学生にでもできるなら、同じやり方でその先生とやらに一回やって見せろと言ってみては？ それとあまり詳しく書かなくても構いませんが、どんなマウス(ノックアウト、トランスジェニック等)を使って何をPCRしているのか書いた方がいいですよ。 分子生物に関わりのないラボがノックアウト、トランスジェニックを作製してるとは思いませんが。もちろん、質問者さんは知ってますよね。

(無題) 削除/引用 No.2697-44 - 2010/06/09 (水) 18:08:59 - fish パートさんですよね。 それは問答無用で辞めたらよいと思いますが。 別に無理しなくても、他によいパートはたくさんあると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2697-43 - 2010/06/09 (水) 17:28:32 - レフト お気の毒です。このご時世にこんな危ないことを口にできるボスがいるんですね。刺されたらどうするつもりだろ？ NaOH処理はもちろんタカラの酵素にも有効です。

(無題) 削除/引用 No.2697-42 - 2010/06/09 (水) 17:21:25 - あんこ 1M Tris-HCl, pH8.0を作りました。 ポジコンとネガコンは無いそうです。 次にバンドが出たサンプルをポジコンにするように言われました。 一つ教えてください。 アルカリ処理をした場合にはKOD FXだけしか使えないのでしょうか？ 例えばタカラのTaqでは駄目でしょうか？ KOD FXは高いから無闇に浪費されては困ると注意されました。 私には無理なので辞めますと言ってしまいました。 すぐに辞められたら研究室の評判にも関わるので2年は続けて欲しいそうです。 簡単なことが出来ないと投げ出すようでは私生活でも先が思いやられるので忍耐を身につけろとのことでした。

補足 削除/引用 No.2697-41 - 2010/06/09 (水) 16:24:01 - ちょこ PCRバッファを流用するのは間に合わせの緊急策です。 たくさんのサンプルに対してそのようにしたら、PCR用に足りなくなるのでご注意下さい。 (もしかしたら、バッファでなく水で薄めるだけでも上手くいくことがあるかもしれません。水で薄めるのも間に合わせの緊急策です。)

試薬が全くないとのことで 削除/引用 No.2697-40 - 2010/06/09 (水) 16:20:45 - ちょこ 最悪の場合、NaOHかKOHさえあれば、50mMぐらいの溶液を使って溶かしてから遠心して、上澄み1uLをPCRのバッファ19uLの中に移してよく混ぜて、それを1uLぐらい取って鋳型としてPCRをすれば、NaOHあるいはKOH以外の試薬なしで今日中に結果がでるかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.2697-39 - 2010/06/09 (水) 16:11:19 - NF 同じマウスを用いているということで、問題はやはり技術的なものだと思います。 皆様がおっしゃるように、 ポジコンとネガコンを置く。 尻尾をきちんと溶かして用いる。 それでもバンドが出ない場合は、DNAを精製してPCRをする。 ということになると思います。 上記のようなことがすぐ出来れば２−３日で結果が出ると思いますが、そうでなければ１週間からへたすると数週間かかると思います。このことを上司が理解してくれればいいですが、そうでなければ結果が出るまで非常にストレスな日々が続くと思います。 うまく行くことを信じてがんばってください。

(無題) 削除/引用 No.2697-38 - 2010/06/09 (水) 15:45:09 - ~ 先ほど書いたのは、今日中に結果が出るプロトコルのつもりだったのですが… >KOD FXが古くても大丈夫そうなのでマウスの尾を切ってみじん切りにしてもう一度試してみます。 止めた方がいいと思います。 過去の亡霊に惑わされないようにしましょう。 >一度PCRに失敗している尻尾からDNAは回収できない。 その尻尾の保管条件次第です。 サーマルサイクラーにかけずに、冷凍保存されていれば、回収は出来るでしょう。 DNA抽出用の組織の冷凍保存はどこでもやられている常識です。 まさか、PCRが増えなかったので、外れのマウスだと判断したのではありませんよね。 そうであれば、上司の言っていることは正しいかもしれませんが、ポジコン、ネガコンを用意していない部分に問題があります。 分子生物学がベースの人でなければ、辞めるのも一つの手だと思います。 他の専門の人が独学でやっても、定職につなげるのは難しいのではないでしょうか。

KOD-FX 削除/引用 No.2697-37 - 2010/06/09 (水) 15:05:46 - mom-a ＞KOD FXが古くても大丈夫そうなのでマウスの尾を切ってみじん切りにしてもう一度試してみます。 組織丸ごとより、~さんのおっしゃるように、アルカリで溶解してからの方が良いと思います。是非、やってみて下さい。 私もKOD-FXを使っていますのでご紹介しておきます。基本的には同じことをやっているので、~さんの試薬でも、どちらでもやりやすい方で構わないと思います。 １）組織をカットする。 　私はNoをつけるときに耳を直径1〜2mmに打ち抜いたものを使っています。尾の先でしたら、2mm前後で十分と思います。 ２）50mM NaOH溶液180uLを加え、95℃,10分加熱する。 　完全に溶解はしませんが、問題ありません。 ３）1M Tris-HCl, pH8.0を20uL加えて中和する。 ４）12000rpm, 10min遠心し、上清1uLをテンプレートとして使用する。 ＞遊んでたから結果が出ないのでは？PCRなんか小学生でも出来るって言ってました。 ＞もう辞めようかな････。 困った上司ですね。 まぁ、実際の現場を観ているわけではないので、上司にも言い分があるのでしょうが。 無理に続けることもないかもしれませんが、無理に辞めることもないですよ。（今、不景気ですし。）PCRをマスターすれば今後のプラスになるかもしれないですし。

(無題) 削除/引用 No.2697-36 - 2010/06/09 (水) 14:59:50 - あんこ >同時にバンドが出なかった尻尾からDNAを回収してみます。 と先生に言ったところ一度PCRに失敗している尻尾からDNAは回収できない。と言われました。 理由を聞いたのですが、常識だから自分で勉強してと丸投げされました。 みじん切りにした訳でもなくチューブに固体で残っているのでDNAを回収できると思ったのですが無理ですか？ 何度もごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.2697-35 - 2010/06/09 (水) 14:43:42 - あんこ 皆様、本当に本当にありがとうございます。 他分野の研究室で生物系の試薬が全くありません。 生物系の研究室ではないから極力お金を使わずにやれと指示されていますし、詳しいお知り合いもいないそうで自分で探さなければなりません。 そんな････。 上の方の思いつきでマウスを購入し実験を始めたそうです。 状況を説明して本日中は無理だとご理解いただけましたが、何故出来ないのかわからない。遊んでたから結果が出ないのでは？PCRなんか小学生でも出来るって言ってました。 もう辞めようかな････。 KOD FXが古くても大丈夫そうなのでマウスの尾を切ってみじん切りにしてもう一度試してみます。 と同時にバンドが出なかった尻尾からDNAを回収してみます。 マウスはバンドが出たときと全く同じマウスです。 個体は識別できるので間違えることはありません。 もう1度だけチャレンジしてみます。 それで駄目だったら退職も考えます。

(無題) 削除/引用 No.2697-34 - 2010/06/09 (水) 12:47:30 - ~ 現時点でいえるのは、今の系は再現性が厳しい系で、上司が使い物にならないことくらいだと思います。 そのため、自分で系を立ち上げるしかないでしょう。 ただ、もしマウスでジェノタイピングを行なっているのであれば、ポジコンとネガコンの両方を要求しましょう。 非特異に増えるのであればネガコンでも増えてしまいますし、PCRを阻害する物質が混入すればポジコンが増えません。 その両方があって初めて、PCRがきちんと働いていることを示せるでしょう。 今日中にと言うのであれば、 1)しっぽに0.1% SDS,0.1N NaOH を100ulとH2Oを50ulぐらい入れる。 2)98℃、15min 3)TEを300ulぐらいいいれる。 4)遠心して上清1ulをtemplateに使う でゲノムDNAを回収し、 KOD FXを使って >PCRは98度5分→98度5秒→60度5秒→72度20秒→72度1分→4度∞ を 95度5分 95度30秒→60度30秒→72度1分　を30サイクル 72度1分 4度∞ 位に修正してかけてみてはいかがでしょうか。 また、ラボには他に誰がいるのでしょうか？ ジェノタイピングを行なっているのであれば、 ES細胞を作ったときのゲノムDNAが残っているかもしれません。 親切そうな人がいれば聞いてみてはいかがでしょうか。

PCR産物は・・・ 削除/引用 No.2697-33 - 2010/06/09 (水) 12:32:39 - 名無し' >とりあえず今から昨日失敗したサンプルを100倍に希釈してPCRしてみます。 >その間にポジコンを探してみます。 No21で、昨日失敗したPCRサンプルを再度PCRにかけるということですが、これは多分何も出ないでしょう（出ればラッキーですが） No14、ぶんさんの指摘にある「PCR産物を薄めて」とは、成功したPCR産物のことと思いますよ。degenerate PCRにおいてPCR産物を再PCRすることがありますが、ゲル切り出し（サイズ分画）というステップが加えてあります。 >PCR産物はややこしいのでバンドを確認したら毎回破棄するよう指示されてい>て残っていません。 これは遺憾ですね。初めてPCRを行うならポジコンは必須です。ちょうど良いポジコンになったのに・・・。ともかく皆さんが指摘されるように鋳型が第一被疑者と思います。No31さんのように軽く精製操作をかますか、メーカーに頼み込んでゲノム精製キットの試供品をもらうのが良いでしょう。組織を直接PCRにかけるのは、ポジコンが確実に出るようになってからの話です。

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