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分注してますか？ 削除/引用 No.2697-72 - 2010/06/10 (木) 20:20:14 - 名無し' ネガコンの話が出たついでに。質問者さんは、PCR試薬（10×Buffer, dNTPs, Taq等）を分注保存してますか？（1mlの10×Bufferを、0.2mlずつ小分けして凍結保存とか） もしまだなら、目出度くPCRが成功する前に行うべきです。目的遺伝子のPCR産物は、それ自身が理想的な鋳型になるため、ほんのわずかでもPCR試薬に混じると目も当てられません（鋳型を入れないネガコンでも、強いバンドが出ます）。エアロゾルの形で空気感染？もします 特にフィルターチップを使っていないとか、PCR試薬とPCR産物（反応後の液）を同じピペットマンで扱っている場合は危険です。高いTaqを捨てて買いなおす破目になります。

おや、失礼しました。 削除/引用 No.2697-71 - 2010/06/10 (木) 18:01:56 - mom-a ＞95℃まで上がっているかもしれないのに、手を押しつけて根性焼きするようなアホならこんな掲示板で何を聞いても無駄。でも質問者はそうじゃない。 どこにレスしているのか読み違えてしまいました。 No.2697-69の書き込みの温度に関するところは無視して下さい。

(無題) 削除/引用 No.2697-70 - 2010/06/10 (木) 18:00:27 - ~ >[Re:68] 123さんは書きました : > さらにバンドが出ないと言ってるのにネガコンの話してどうする。 私に対してですかね。 今の状況であれば、非特異でも増えれば進歩だというのには同意します。 ただ、ネガコンをおいておけば、少なくともそのネガコンでは増えてこない産物であることがその回の実験で確認できます。 おかれていなければ、今度は非特異産物かどうかの検討用にもう一度実験することになるでしょう。 プラスミドがテンプレートであればまだしも、マウスのゲノミックPCRできれいに増えることは期待できないと思います。 コントロールをおかない実験は時間とコストの無駄だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-69 - 2010/06/10 (木) 17:58:06 - mom-a ＞さらにバンドが出ないと言ってるのにネガコンの話してどうする。 ＞この場合ノンスぺでもバンドが出たらtaqがへたっていない、機械が壊れていない、電気泳動に問題ないという大きな進歩だ。 で、それからもう1回ネガコンを入れてノンスペかどうか…なんてやるくらいなら、最初にネガコン1本足した方が早いと思いますけど。 「今回バンドが出たらそれをポジコンに」ということでしたが、それがノンスペのバンドだったら意味がないでしょう？ ずっとネガコンなしだったのだから、最初に「出ていた」と思っていたバンドが目的のものではなくてアーティファクトだったかもしれないわけですし。 ＞95℃表示されているのに触れる程度の温度ならば壊れているのは確定だろ。 機械の蓋に外側から触ったら熱かったという話じゃないんですか？ ヒートブロックに直接触ったわけじゃないと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.2697-68 - 2010/06/10 (木) 16:26:28 - 123 サーマルサイクラーの故障に関する情報が何もなかったから疑う必要があっただろ。95℃まで上がっているかもしれないのに、手を押しつけて根性焼きするようなアホならこんな掲示板で何を聞いても無駄。でも質問者はそうじゃない。95℃表示されているのに触れる程度の温度ならば壊れているのは確定だろ。 さらにバンドが出ないと言ってるのにネガコンの話してどうする。この場合ノンスぺでもバンドが出たらtaqがへたっていない、機械が壊れていない、電気泳動に問題ないという大きな進歩だ。 勉強しろなんて3番目のレスに出てるぞ。

(無題) 削除/引用 No.2697-67 - 2010/06/10 (木) 15:06:43 - あんこ 先生は思いつきであれこれ提案はしてくれますが、その根拠は私が調べてお伝えしなければなりません。 素人同士が何を話しても意味が無い気がします。 思いつきで生物に手を出すような方なので発想は豊かなんですね。 サービス残業は強制では無く、あくまでも私が自主的に行うものだそうです。 サー残や休日出勤は一切しません。決めました。

(無題) 削除/引用 No.2697-66 - 2010/06/10 (木) 15:01:04 - レフト > 勤務時間は「出来ない人は出来るまで残る」ことや休日出勤は常識で、そのつもりでと念押しされました。 > 契約違反である旨をお伝えしましたが強制するわけでは無く私が自主的に残って貢献すべきだと言っていると言われてました。 論外ですね。サービス残業はキッパリと拒否すべきです。ここで負けてはどこまででも付け入られかねませんよ。 > 朝から雑務をやり先ほど50mM NaOHを作りました。 NaOH溶液は空気中の二酸化炭素を吸ってすぐにpHが下がってしまうので、作り置きにするときには10M程度のものを密栓できる容器に保存しておいて、使用の直前に希釈することをお勧めします。 > それと一度PCRをかけた尻尾からなぜDNAが回収できないのか理由を述べよといわれております。 > 尻尾の形が残っている以上はDNAが含まれているはずだと先生はおっしゃいます。 DNAが回収できないというのは、No.2697-36によればそのボスの主張だったのでは？というツッコミを別にすれば、No.2697-48にも書きましたが、私もDNAは取れると思いますよ。 無理の無い範囲で頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.2697-65 - 2010/06/10 (木) 14:51:01 - お気の毒に >ポジコンですがTaqを購入した代理店がどこか解らないので自分で調べて問い合わせることになりました。 技術的な相談ですので代理店ではなくメーカーです。 タカラの酵素を使っているならタカラに電話して「技術的な相談をしたいのでＰＣＲの担当者をお願いします」と言えばいいです。 割に合わないと思ったら人事課とか、サービス残業を強要されているなら労基署に相談して辞めるのも選択肢かもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.2697-64 - 2010/06/10 (木) 14:50:58 - ああああ >[Re:63] あんこさんは書きました : > それと一度PCRをかけた尻尾からなぜDNAが回収できないのか理由を述べよといわれております。 あれっ、これって先生に言われたんじゃなかったでしたっけ？ > 尻尾の形が残っている以上はDNAが含まれているはずだと先生はおっしゃいます。 回収できると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2697-63 - 2010/06/10 (木) 14:39:16 - あんこ お世話になっております。本当にどうお礼をお伝えしたいいのかわかりません。 朝から雑務をやり先ほど50mM NaOHを作りました。 先生に「ここまでできるPCR」と言う書籍を渡され、これがあれば何でもできると託されました。 私にはチンプンカンプン。 勤務時間は「出来ない人は出来るまで残る」ことや休日出勤は常識で、そのつもりでと念押しされました。 契約違反である旨をお伝えしましたが強制するわけでは無く私が自主的に残って貢献すべきだと言っていると言われてました。 >何も教えなくても一人でバリバリできる研究者が欲しかったのなら、そういう人を選べば良かったわけで、未経験者を採用した方が悪い… これも伝えました。研究者を採用するとお金がかかるので安上がりの補佐員が良いそうです。安上がりで仕事が出来れば一石二鳥だそうです。 PCRの機械は触れる程度ですが蓋がかなり熱くなっていました。 多分、大丈夫？ ポジコンですがTaqを購入した代理店がどこか解らないので自分で調べて問い合わせることになりました。 そもそも生物の業者さんも出入りしません。調べようが無い。 それと一度PCRをかけた尻尾からなぜDNAが回収できないのか理由を述べよといわれております。 尻尾の形が残っている以上はDNAが含まれているはずだと先生はおっしゃいます。 長文になりすみません。

それから 削除/引用 No.2697-62 - 2010/06/10 (木) 00:02:23 - ちょこ 機械の温度が上がっているか触ってみろというような書き込みが ありますが、手で触っても80度なんだか95度なんだか分かること は、ほぼないと思いますので、手で触って確かめない方が良いと 思います。 チューブを乗っける金属の部分をブロックと呼ぶのが一般的だと 思いますが、ブロックの温度制御が全然ダメになるということを 疑うよりも、鋳型の調整やPCRのアニーリングの温度やサイクル 数などをきちんとすることの方が先だと思います。

バンドが出ればよいというわけではない 削除/引用 No.2697-61 - 2010/06/09 (水) 23:51:40 - ちょこ PCRは、想定した産物でない副産物ができることのある反応です。 はっきりとしたバンドが1つ出たからといって、正しい反応が 起きているとは限りません。 このことを検証するために、陰性対照(ネガコン)と、想定して いる産物の長さの情報が必要です。後者について、そのプライ マーと鋳型からできる正しい産物の長さを把握していますか？ また、電気泳動の際にPCR産物の長さを推定するような工夫を していますか？ それから、もし遺伝子工学系の技術を身につける気持ちがある ならば、この掲示板で相談するだけでなく、実験書の類を手許 において勉強する必要があります。 もし、実験書を買ってもらえなくて(ダメなボスのように見受け られるので、あまり余計なことを言わない方が良いかもしれま せん)という状況ならば、TaqやKODを購入した代理店に電話して NEBという酵素メーカーのカタログを至急持ってきてもらいま しょう。後ろの方に、実験について参考になる情報があります。

(無題) 削除/引用 No.2697-60 - 2010/06/09 (水) 22:05:15 - 名無し' いろいろ大変みたいですね 多分、多くの方がアドバイスされたようにゲノムをNaOHで精製すれば成功すると思いますが、不幸にしてダメだったら”お気の毒に”さんの示唆通り、他の人にポジコンをもらうのがいいでしょう。この場合の「ポジコン」は大概プラスミドとプライマーのセットで、「ＰＣＲ反応自体がちゃんと行われているか」の確認が目的です。これで、 １．使用しているTaqやdNTPsが生きているか ２．PCR機械が壊れていないか ３．染色液と電気泳動に問題ないか　 の三点を押さえられます（どうみても、鋳型の調製が問題っぽいですけど） もし研究室のアテが全く無いなら、使用しているTaqのメーカーに電話して、 「貴社のTaqを使っているのだけどポジコンがありません。適当なポジコンを貰えないでしょうか？」と言えば間違いなく貰えます。プラスミドもプライマーもタダみたいなものだし。（お使いのTaqに添付されているかもしれません）

(無題) 削除/引用 No.2697-59 - 2010/06/09 (水) 21:33:29 - お気の毒に >他のどのラボがPCRしてるのかも知らないし 意外とどこでもやってると思います。 他の研究室に習いに行くことのOKも出ているなら、「お忙しいところ申し訳ありません。〜と申しますが、そちらの研究室でPCRを専門とされている方はいらっしゃいますでしょうか。大変申し訳ないのですが技術的な相談がありまして・・・。」などと研究室訪問しちゃったらいかがでしょうか？ ポジティブコントロールくらい提供してくれると思います。 （私だったら提供します）

(無題) 削除/引用 No.2697-58 - 2010/06/09 (水) 21:13:46 - mom-a 「パート」に無給で残業や休日出勤させるような契約はないはずです。むしろ、スタッフや社員がいない時間に仕事をさせるのは本人がやるといってもやらせないのでは…まぁ、危機管理が甘そうな上司さんですからねぇ。 何も教えなくても一人でバリバリできる研究者が欲しかったのなら、そういう人を選べば良かったわけで、未経験者を採用した方が悪い…。 長く居てもいいことはなさそうですし、そんな必要はないと思います。ただ、ご自分に不利になるような辞め方をする必要もないと思います。次の仕事が決まるまでいた方が良いなら、それまでは居座って構わないでしょう。辞めるなっていうんですから。ただ、それで体を壊したりしては元も子もありません。 お勤め先がどういうところかわかりませんが、例えば大学などの研究室でしたら大学の人事部が、企業内の研究部でしたら会社の人事部がありますよね？そういったところへ相談することを考えてみても良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-57 - 2010/06/09 (水) 20:27:11 - ~ >仕事が出来ないなら土日も来て当たり前だと言われました。 契約はパートですよね。 文書で自由に残業、休日出勤の許可を貰って、 暇な時間は研究室に来た記録を残し、その分の給料を請求しましょう。 確かに時間無制限で研究をしている人たちはいますが、時間を切り売りしている貴方とは異なります。 研究結果次第で来年以降の年収やポジションが決まったり、やらないと学位を取れない人たちでしょう。 既に実験の問題ではなく、労働問題になっていると思います。 2つは分けて相談した方がいいと思います。 ----------------------------------------- マウスの尻尾を切り刻んだものをPCRチューブに入れてPCRをかけることを容認している上司であれば、PCRの具体的な操作について相談することは止めた方がいいと思います。 時間の無駄でしょう。 >そのときのプロトコルは >95度5分 >95度30秒→60度30秒→72度1分　を30サイクル >72度1分 >4度∞ ネックは、アニーリングの温度（60度）が妥当かどうかが分からない点です。 貴方が情報を小出しにしているために、そこまで話が進んでいないだけです。 本来はアニーリング温度は条件検討の1つのパラメーターで、かなり重要です。 温度の勾配を付けられるサーマルサイクラーがあれば、50度〜60度くらいまでの範囲で振ってみましょう。 無ければその温度で1回かけて、何も増えなかったら55度くらいにしてかけてみるなど、PCR数回分の時間を使って温度条件についても条件検討が必要です。 ただ、ポジコン、ネガコンが無いと、検討結果が適切なのかが判断できません。 アニーリングの温度以外は多少違ってもそれほど影響しないと思います。 明日以降の課題としては、下記の3点が上げられると思います。 １．ゲノムDNA抽出方法 おそらくこれは皆さんが書いている方法を使えば、”検討”は必要ないと思います。 ２．ポジコン、ネガコンを探す テンプレートを入れないのもネガコンの1つですが、 マウスのゲノムDNAを使っているのであれば、その”増やしたい部分”が無いマウスも、いいネガコンになります。 テンプレート無しは、PCR mixへのDNAのコンタミを検出できますが、 ネガコンマウスでは、プライマーの非特異な結合なども検出できます。 マウスがラボで作ったものであれば、作るまでに使用した細胞などの材料があるはずです。 遺伝子改変マウスを作れるだけの頭がある人がいるはずですので、その人を探しましょう。 ３．PCR条件の検討 アニーリング温度はそれなりに振らないといけません。 信用できるコントロールがあれば、例えば、アニーリング温度を １回目：６０℃→増えない ２回目：５５℃→非特異にバンドがたくさん増えた ３回目：５７℃→ちょうどシングルバンドで増えた などで、調節していくことが出来ます。 大きめに範囲を振って、どの範囲内に適切な条件があるのかを狭めていくのが効率がいいと思います。

まぁ 削除/引用 No.2697-56 - 2010/06/09 (水) 20:15:09 - ami 基本的には、業績を追求する立場になければ、自分の幸せに軸足を置いて考えるのが正しいです。実験をしていて楽しいのであれば続けるし、難しい人間関係でやってられないのであればやめる、みたいな。 PCR反応液に尻尾をそのまま入れるのは異常です。先の方が書かれているように、かなりの量のアルカリで溶かして、その数百分の一を入れるだけでも、しばしば多すぎて失敗します。尻尾の量の加減では決してうまくいきません。 サーマルサイクラーの温度調節は故障してませんか？ウェルに水を張って温度計を挿して確認します。 サイクルの設定が間違ってませんか？昔の１行しか表示しない画面だと、間違えたりします。 水は大丈夫ですか？排水からミリＱ作ってたりして、、 ピペットの計量がおかしかったり、、水をはかりとって重さ量ってみましたか？ もっとあるかも、、 経験者がいないラボでは、きりがないほど検討すべき点があると思います。というか経験者がいないと絶対無理、、 解決しようと思うのなら、ＰＣＲをやってるラボがないか聞いて回って教えてもらうのがたぶんベストです。

(無題) 削除/引用 No.2697-55 - 2010/06/09 (水) 19:59:26 - あんこ レフト様 おっしゃるとおりでした････。 仕事が出来ないなら土日も来て当たり前だと言われました。 研究者は、土日祝日も無く仕事をしているそうです。 そうなんですか？？？？？ もう帰ります。 ご助言くださった皆様、きっと明日も何かしらお聞きすると思います。 呆れるような素人ですが頑張りますので、またよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2697-54 - 2010/06/09 (水) 19:54:54 - 123 サーマルサイクラーを空回ししてちゃんと95℃まで温度上がっているのかとか確認も。触って熱ければいいですけど。

(無題) 削除/引用 No.2697-53 - 2010/06/09 (水) 19:45:44 - レフト 20マイクロリットルに1ミリというところはそれでも多すぎるとは思いますので、No.2697-50に従った方が良いと思いますが、それ以外はNo.2697-51のとおりで良いと思います。 それから、そういうボスの下でサービス残業はしてはいけません。それが当たり前にされてしまいますよ。

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