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(無題) 削除/引用 No.2693-17 - 2010/06/09 (水) 13:21:02 - みみ ボスとの関係を考えれば，- ~さんのおっしゃる通りだと思います。 ただ，普通に考えたら臓器を変えるという選択肢は絶対にファーストチョイスでは無いと思います。また臓器をつぶしてRTするのが面倒くさいです。 クローニングにはそんなに大量のDNAは必要ありません。950bp程度であれば，バンドが目で見える量あれば確実に十分です。現段階で見えるバンドをベクターに組み込む方が断然早いように思われます。 私は通常， PCR→ゲル切り出し・精製→RE処理・精製（フェノクロ）→ライゲーション というステップで処理しています。 ただ，たまに（何十個のうち一個とか）うまく入らないときがあります。その時はゲルから切り出したものをTAクローニング（かブラントでクローニング）してから，もう一度載せ替えるようにしています。理由はよく分かりませんが，これでほとんどうまく行っています。

(無題) 削除/引用 No.2693-16 - 2010/06/09 (水) 12:56:32 - ~ １．ボスが他の臓器でやることを薦めている ２．貴方の目的が目的遺伝子のクローニングであり、由来の臓器はどうでもいい ３．貴方に思い当たる部分がある ということであれば、 ボスの薦めにしたがって他の臓器を使い、 貴方の思い当たる部分を全て貴方好みに修正したプロトコルで作業し、 クローニングすればいいのでは？ ここで貴方が使っていた臓器に固執してやり直してうまく行かないと、 ボスから言うことを聞かない奴だと思われるようになるでしょう。 臓器を変えれば、とりあえずはボスの顔は立ち、うまく行かなくても臓器が原因ではないことが分かります。 >UVも気を付けます。 DNAに当てるのは0.5秒未満にしましょう。 ランプをつけた最初の瞬きで十分です。

~様 削除/引用 No.2693-15 - 2010/06/09 (水) 11:44:26 - さやな ありがとうございます。 余分な配列は付けてあります。引き継ぎの実験で、設計した人は他の人ですが、自身で確認しています。 具体的な答はない状態です。研究室で、今まで動いている方法でやれば間違いないと。。私の書き方が悪かったかもしれませんが、もっとよい(すんなりいく)臓器があるかも、ということです。 ~様のおっしゃる、まれな状況のことは言われました。。

パイプ椅子様 削除/引用 No.2693-14 - 2010/06/09 (水) 11:37:11 - さやな 返信が遅くなり、すみません。 難易度は高くないと思うからか、焦っている自分もいます。 ゲルからの切り出しをしているので、それなりのバンドが見えていますが、その後は上司と同じ方法です。ただ、濃度が原因かも、、とは思っていました。ご指摘頂き、ありがとうございます。形質転換時に、濃度を振ってみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2693-13 - 2010/06/09 (水) 10:29:31 - ~ >切りたい制限酵素サイトはプライマーに付加してあります。 >末端は突出で、Bgl�UとEcoR�Tです。 当たり前すぎて書いていないのかもしれませんが、 プライマーに”余分な配列”はつけていますよね。 上司と貴方が同じプライマーを使用しているという記載が見当たらないのですが。 >PCR後の泳動の写真は見てもらっています。 大事なのは上司の視野に写真を入れることではなく、その先です。 目的の位置にあるDNAのバンドを見ているのに、臓器がおかしいといい続けているのであれば、その根拠を聞きましょう。 臓器が問題であるとすれば、 「たまたま目的の産物と同じ位置に、その臓器特異的なスプライシングバリアントが片方のプライマーのみによって増幅された」 位、まれな状況だと思いますが。

おそらく 削除/引用 No.2693-12 - 2010/06/07 (月) 22:04:04 - パイプ椅子 さやなさん、こんばんは。 ここの住人はみなさんプロフェッショナルが多いので、少しでも 言葉足らずだと突っ込まれますねｗｗ さて、クローニングですが、特に難易度の高いものではないですね。 恐らくさやなさんの上司はかなり薄い濃度のPCR溶液をLigationに、 薄い濃度のLigation反応液を形質転換にそれぞれ用いておられるのでは ないでしょうか？　Ligationがうまくいかない原因はPCR液の持ち込みで あろうと思いますし、形質転換がうまくいかないのはDNA濃度が高すぎる からだと思います。最近の実験本には載っていませんが、形質転換の効率は DNA濃度が高ければ高いほど低くなりますね。 よって一度、Ligation液を10倍〜50倍（←適当です）希釈して形質転換 されてみてはいかがでしょうか？ あとは、他のみなさんがおっしゃるようにステップごとに精製を素直に入れて いくことかと思います。

nnn様 削除/引用 No.2693-11 - 2010/06/07 (月) 15:16:49 - さやな ありがとうございます。 PCR後の精製は行っていました。 他のステップに関しては、以前やっていましたので、今回少し不安が残っていました。 どの段階も手落ちのないよう、気を付けます。

パイプ椅子様 削除/引用 No.2693-10 - 2010/06/07 (月) 15:13:26 - さやな ありがとうございます。 まだ試すことが色々ある状態の上、あまり詳しく書けない状態ですみません。 今回はクローニングですが、サブクローニングの経験は何度かある非医師です。 インサートは950bp、ベクターは4.7kbpです。 末端は突出で、Bgl�UとEcoR�Tです。 Ligationの条件は、17℃、2-4時間です。 大腸菌株はJM109です。 思い当たる所は今後直していきます。

(無題) 削除/引用 No.2693-9 - 2010/06/07 (月) 15:12:13 - nnn 各ステップの反応後の精製は重要と思うのですが。。。 例えば、 PCRの反応液に、制限酵素を直接入れて切ることが出来る場合もありますが、 その反応後、熱変性で制限酵素を失活させようとした場合、 PCRで使っていたDNAポリメラーゼが、せっかく制限酵素で切断した部分を平滑化しますので、結果的に失敗します。

~様 削除/引用 No.2693-8 - 2010/06/07 (月) 15:02:58 - さやな ありがとうございます。 投稿後に気付きましたが、直さず、すみません。クローニングです。 周囲を気にするあまり、はっきり書かずに申し訳ありません。 私はPCR後のステップを疑っていますが、ほぼ同じ方法で行っている上司が成功しているため、上司は臓器を疑っています。PCR後の泳動の写真は見てもらっています。 まずは研究室の方法に沿って、ということだったので、今後は手抜きはしません。以前に経験のある方法を活かして、自分なりの方法を考えていきます。UVも気を付けます。

ぶん様 削除/引用 No.2693-7 - 2010/06/07 (月) 14:53:03 - さやな ありがとうございます。 周囲に分かってしまいそうで、詳しく書かずにすみません。パイプ椅子さんへの返信に、詳しく書きます。 PCR産物は目的の大きさで、切りたい制限酵素サイトはプライマーに付加してあります。 TAクローニングは経験があるので、視野には入れていました。 処理の件は、断片の精製やガラスビーズを用いてのDNA精製を考えていました。

感想 削除/引用 No.2693-6 - 2010/06/07 (月) 01:37:26 - パイプ椅子 このかたは臨床のお医者様かな？と思われます。

以下の点について 削除/引用 No.2693-5 - 2010/06/07 (月) 01:35:05 - パイプ椅子 以下の事項をご記載ください。 インサートおよびベクターの長さ 末端は粘着or平滑？　末端制限酵素の名称 Ligation時の条件 形質転換に用いた大腸菌株 ”制限酵素切断後の処理やゲルからの切り出し後の処理はやっておらず、私はそこに原因があるように思”うのであれば、一度それを試されてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2693-4 - 2010/06/06 (日) 23:27:04 - ~ >サブクローニングを行っています。 私の認識だと、貴方はクローニングを行っていると思いますけど。 実験の目的がさっぱり分かりません。 >当たりの臓器のバンドは、目的の大きさに一本きちんと出ています。 である以上、そのバンドをクローニングし配列が異なるという結果が得られるまでは、 PCRより後のステップの問題を疑うべきでしょう。 >最初のRNA抽出の臓器が原因ではないかと言っています。 といっている人に、上記のPCR後のゲルの写真は見せたのですか？ その上で、臓器が原因だと判断する根拠があるかを聞きましょう。 >臓器が駄目かを確認する前に バンドが得られている以上、臓器に問題があると判断する根拠はないでしょう。 手抜きの実験でうまくいかないのを、臓器がダメであると判断する根拠にするのは暴論だと思います。 >インサートが入ったものが取れません。 では、何が取れたのですか？ セルフライゲーションがとれても、ごみが入っていても、 ベクターやインサートの調整がおかしいことを意味し、 臓器がダメであることを意味しないでしょう。 手抜きの実験法でうまくいった人がいることは、 貴方もうまくいくことを意味しません。 貴方が適切なコントロールを置いていれば、貴方の操作のどこに問題があるかは既に判断できたと思います。 単純にUVのかけすぎだけでも、もくてきのクローンが得られないことはあります。

(無題) 削除/引用 No.2693-3 - 2010/06/06 (日) 23:20:33 - ぶん もうちょっと詳しい手順を書いた方が良いと思います。 PCR産物を制限酵素で切ってベクターに入れてるんですよね？ そのPCR産物が本当に目的の物なのか、 切りたい制限酵素サイトが本当は存在しない可能性はありませんか？ 一番簡単なのはTAクローニングだと思うのですが、TAクローニングは出来ないのでしょうか？ >制限酵素切断後の処理やゲルからの切り出し後の処理 の意味がよくわからないのですが、フェノクロとかエタ沈のことですか？

サブクローニングが上手くいかない原因 削除/引用 No.2693-1 - 2010/06/06 (日) 21:10:31 - さやな 臓器からRNAを抽出し、RT-PCR後、それをインサートにし、サブクローニングを行っています。 いくつかのベクターを試しましたが、インサートが入ったものが取れません。 制限酵素切断後の処理やゲルからの切り出し後の処理はやっておらず、私はそこに原因があるように思いますが、それをやらなくても上手くいっている人もいます。 その方は、最初のRNA抽出の臓器が原因ではないかと言っています。いくつかの臓器をRT-PCRをかけ、発現が確認できたものが一つだったので、もっと臓器のサンプルを増えそうかとも思います。 当たりの臓器のバンドは、目的の大きさに一本きちんと出ています。 臓器が駄目かを確認する前に、直せる所は直そうと思いますが、臓器や培養細胞を変えたら上手くいったという方、いらっしゃいましたら、教えて頂けませんでしょうか。

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