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同じような 削除/引用 No.2692-7 - 2010/09/22 (水) 10:28:54 - しあ 実験をしています。 そのmediumは何か処理を施していますか？ また電気泳動の方法は何を用いていますか？？ もしかすると分子量が大きすぎてうまく泳動できなかったかもしれません＞＜ わたしもその状態です。 回答が遅くなって今は解決できたかもしれませんが、 もしよろしければ、現状をお聞かせください。

ありがとうございました。 削除/引用 No.2692-6 - 2010/06/07 (月) 10:00:51 - collagen アドバイスありがとうございました。 再検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2692-5 - 2010/06/06 (日) 20:56:54 - 名無し すでに指摘があるように分泌蛋白質を見る場合は、血清入り培地では難しい事が多いです。血清入り培地の場合、定量して測定された、また電気泳動で観察された蛋白質のほとんどは血清のものです。培養細胞では、一般に培地中の分泌蛋白質は微量です。ゆえに分泌蛋白質を見たいならば無血清培地で細胞を一定期間培養した後、コンディションドメディウム(CM)を適当な方法で濃縮してから実験に供する事が多いです。最近は無血清培養のための完全合成培地もあるとおもいますので培地関係のメーカーに聞いてみて下さい。CMの濃縮方法はいろいろですが、生物活性を保持したいなら硫安濃縮などがあります。コラーゲンということなので、膜による限外濾過濃縮や酸沈殿は避けた方がいいでしょう。あと蛋白質をスピードバックで濃縮するということは？です。一度カラカラになってしまったら、溶かすのはたとえSDSでも非常に困難になりますし、器壁への強固な吸着も起こりやすい（ただでさえ接着蛋白質は実験過程での吸着lossが大きいです）ので、その後の実験には使えなくしてしまう可能性が懸念されます。液体成分をとばして濃縮したいなら蛋白質の場合は凍結乾燥がよいとおもいます。コラーゲンはとても高分子量と思いますので、7%前後低濃度ゲルを使い、転写時間なども留意した方がいいでしょう。 実験手順を拝見させていただいたのですが、上記のことなどで、すこし不自然な印象があるので、もう一度参照された実験書なりノートを見て誤記、誤解がないかよく確認して下さい。またこのような実験に十分な経験のある方にも見せて意見を聞いた方がいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2692-4 - 2010/06/06 (日) 19:09:35 - ~ ゲルかトランスファーしたメンブレンを、CBBやポンソーＳなどで染めてみてはいかがでしょうか？ 培養上清画分で66kD位に強いバンドが見られたら、TSさんの書かれているように、FBS由来のBSAを測っている可能性が高いでしょう。 (1) これで本当に飼えるのですか？ 血清飢餓で分裂しないと思うのですが。 (2) 培養上清のWBだと無血清状態でタンパク質を分泌させることが多いと思いますが、 ここでFBS濃度を振っているのは何か元になる報告があるのでしょうか？ また、実は(1)でFBSが入っている状態の培地を用いている場合、洗いが足りないと、BSAが持ち込まれます。 その点は大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2692-3 - 2010/06/06 (日) 18:59:57 - TS 最初に。(3)の溶液ボリュームは、単位が間違っているのですよね？ 細胞抽出液でうまくいっているようですし、そもそも培地中には「ない」か「検出限界以下」という考察をされているのですか？ だとすると、けっこう厳しいのかなぁという気もしますが、既報で報告があるのでしょうか？ またちなみにですが、タンパク量として、１００μｇくらい流しているようですが、これは分泌タンパク質由来のものが多いのでしょうか？ なんとなく、ほとんどがFBS由来のBSAなのかな、と思いました。 （FBSが高濃度のサンプルで、タンパク濃度が高くなっていますか？）

修正（文字化けしてしまいました） 削除/引用 No.2692-2 - 2010/06/06 (日) 17:42:23 - collagen こんにちは、線維芽細胞でコラーゲンの研究をしています。 medium中に分泌されたsoluble collagen type�Tのwestern blotを行いたいのですが、全くバンドが検出されず悩んでおります。 手順は下記のように行っています。 （１）fibroblast 培養 (DMEM FBS添加なし） （２）80~90% confluentでmedium change(DMEM+ 0 or 0.1 or 0.5 or 1 or 2.0%FBS) （３）24時間後にmediumを回収し、0.22マイクロメートルフィルターを通したのちに、speed vacで濃縮（0.5マイクロリットルをを0.2マイクロリットル程度にまで） （４）Bichinohic acid assayで濃度測定 （５）80または100マイクログラムprotein＋6×SDS添加でprotein loadingの準備 （６）8% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels （７）membraneに転写後1st,2nd処理 細胞から抽出したproteinを使用して（４）以下の手順で行うとバンドは検出されるのですが、どうしてもmediumからではバンドが検出されません。アドバイスいただければ幸いです。よろしくお願いします。

分泌コラーゲンのwestern blot 削除/引用 No.2692-1 - 2010/06/06 (日) 17:38:21 - collagen こんにちは、線維芽細胞でコラーゲンの研究をしています。 medium中に分泌されたsoluble collagen type�Tのwestern blotを行いたいのですが、全くバンドが検出されず悩んでおります。 手順は下記のように行っています。 （１）fibroblast 培養 (DMEM FBS添加なし） （２）80~90% confluentでmedium change(DMEM+ 0 or 0.1 or 0.5 or 1 or 2.0%FBS) （３）24時間後にmediumを回収し、0.22µｍフィルターを通したのちに、speed vacで濃縮（0.5µlを0.2µl程度にまで） （４）Bichinohic acid assayで濃度測定 （５）80または100µg protein＋6×SDS添加でprotein loadingの準備 （６）8% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels （７）membraneに転写後1st,2nd処理 細胞から抽出したproteinを使用して（４）以下の手順で行うとバンドは検出されるのですが、どうしてもmediumからではバンドが検出されません。アドバイスいただければ幸いです。よろしくお願いします。

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