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解決しました 削除/引用 No.2691-6 - 2010/06/10 (木) 19:00:49 - バイオ初心者 遅くなり申し訳ありませんが、結果報告です。 精製物を電気泳動したところ、バンドがでました。 また、精製産物を希釈したスタンダードも無事、 リアルタイムで立ち上がりました！ TS様、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.2691-5 - 2010/06/06 (日) 14:17:16 - バイオ初心者 お答えいただきありがとうございます。 分かりました、とにかくやってみます。 精製前の高いの吸光度は、Primer・dNTPsと推察しながらやってみます（笑） ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2691-4 - 2010/06/06 (日) 14:08:50 - TS とりあえず、やってみたら良いと思いますよ。というのは、私の指摘が正しいとは限りませんから（笑 なので、バンドが出なかったら、すみません。 他の可能性を考えましょう。 もしちゃんとバンドが出れば、ご自分で考察されるのが良いかと思って、控えめにお答えしています。 ヒントは、吸光度を与える物質はなにか？　ですね。 PCR後のサンプルに入っていて、精製後のサンプルには入っていないものがたくさんあるのではないですか？

(無題) 削除/引用 No.2691-3 - 2010/06/06 (日) 14:01:30 - バイオ初心者 TS様、素早いお返事ありがとうございます。 ＞どこかでロスしている、と考えているようですが、 おっしゃるとおりです。 明らかな根拠はありませんが、フィルターに詰まった（？） などと考えておりました。 そして、ご指摘にある精製物の泳動はまだ行っておりません。 吸光度を見る限り、完全になくなったと思い込んでいました。 泳動をやってみようと思います。 ということは、 精製後のProductは、相当に量が減っているということなのでしょうか？ 精製の過程で、Totalの核酸は少なくとも10倍は減少するのが普通なのですか？ 初歩的な質問で申し訳ありませんが、またお答え頂ければ幸いです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2691-2 - 2010/06/06 (日) 13:48:53 - TS どこかでロスしている、と考えているようですが、 精製後のサンプルをゲルに流して確認してみましたか？ おそらくバンドがちゃんと出ると思います。

PCR producの精製が上手くいかない 削除/引用 No.2691-1 - 2010/06/06 (日) 13:37:23 - バイオ初心者 こんにちは。私は大学の学部学生です。 いつも参考にさせていただいております。 似たトピックが見当たらなかったので新しく立ち上げさせて頂きました。 大学研究室の実験でReal time PCRを行うことになりました。 測定の対象は、RTです（培養細胞のmRNAのcDNAです） 今の問題は、Standard作成のためのPCR productの精製が上手く行かないことです。 Standard用のProductは通常のRT-PCRで得られたものです。 どのように上手くいかないかというと、 精製処理後、精製された（はずの）Productがなくなっている（？）のです。 具体的に、A260の吸光度が精製前と比べて極端に減少しています。 Nanodrop-1000を用いて核酸濃度を測定しており、A260は以下のようです 精製前のProduct：Abs=約3.075 精製後のProduct：Abs＜0.050 勿論、Productは電気泳動でバンドが出ることを確認済みです。 どのような精製処理を行っているかは、以下の通りです。 精製キットを用いてますが、社名・製品名はご要望があったら公開したいと思います。 精製キットは、遠心によりフィルターを通してProductをろ過するというものです。 僕の場合、一回目のろ過で、すでにAbsが0.05以下になります。 念のため、フィルターカップの下のろ液も測定していますが、上のものと同様の結果です。 このような極単純な操作で、間違えようがないはずですが、なぜか上手くいきません。 どなたか、このような精製を行っている方で何かアドバイスを頂ければ幸いです。 よろしくお願いします。

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