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(無題) 削除/引用 No.2683-12 - 2010/06/08 (火) 13:23:07 - 蜜柑 すみません、サンプル成分ではなくグリシンがカラムにあまり良くないと思っていたので。サンプルに関しては、透析を入念にして糖を十分除いてからカラムにかけてみます。 ありがとうございました。 カラムにくっついた糖については塩酸で流す方法を提案してみます。

(無題) 削除/引用 No.2683-11 - 2010/06/07 (月) 17:19:41 - ザンギ 平衡化バッファーだけでカラムが詰まらないのならサンプル成分ではないのですか？ >サンプル(粉状)に元々糖が入っています。 これが多糖の類ならバッファーの条件によってはゲル化する可能性がありますね。 単糖やオリゴ糖がゲル化するのかは知りませんが、小さい糖なら透析で除けます。 多糖ならゲルろ過が有効でしょうか。 もう少し質問の仕方を考えてから投稿されたらいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2683-10 - 2010/06/07 (月) 14:15:11 - 蜜柑 段階希釈…なるほど… 平衡バッファーが100mM Glycineでなければいけない、と思っていたので薄めるのは思いつきませんでした。 >平衡化バッファーではカラムは詰まらないんでしょうか？ とりあえずは大丈夫そうです。 流れが遅くなったりはしていない様子です。 >糖はどこに入ってるんですか？ カラムにかけようとしているサンプル(粉状)に元々糖が入っています。粉状のサンプルをバッファー(20mM Tris/HCl, 50mM NaCl, 100mM Glycine pH7.5)に溶かして遠心し、溶けきらなかった不溶物は除いています。が、恐らくサンプルの溶液中にタンパク質と一緒に糖も溶けていると思われます。 >尿素で洗った理由は？ 詰まっている原因がタンパク質だと思ったので、6M尿素で洗いました。カラムを洗うときは基本的に酸塩基ではなく、尿素で洗うように言われています。

(無題) 削除/引用 No.2683-9 - 2010/06/07 (月) 12:53:43 - ザンギ グリシンで詰まるかどうかしりませんが、カラムが流れなくなったらビーカー にだしてバッファーを段階希釈してやることもあります。 まだいくつか分からないんですが。 平衡化バッファーではカラムは詰まらないんでしょうか？ 糖はどこに入ってるんですか？ 尿素で洗った理由は？

(無題) 削除/引用 No.2683-8 - 2010/06/05 (土) 16:23:32 - 蜜柑 >ここでの塩濃度はNaClですね？ >カラムの平衡化はどうしてるんですか。 平衡化はサンプルが溶けているものと同じ、20mM Tris/HCl, 50mM NaCl, 100mM Glycine pH 7.5で行っています。塩濃度はNaClのことです。 >シングルフラクションに溶出されるということ？ 単一なバンドが確認できるということです。 >酸塩基に弱いＧＥ社のアガロースベース担体を使用されていませんか？ >初段階精製の担体は使い捨てにしていました。 ゲルは確かGE社のSepharose FFです。 使い捨てですか！それは勇気が要りますね…(笑)でも結局詰まったDEAEのゲルは捨ててしまったので、どうせ捨ててしまうのなら酸塩基に耐えられるものに変えるのもありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2683-7 - 2010/06/05 (土) 13:34:54 - Ｇ洗浄のアリア グリシンがカラム詰まりの原因かどうかはさておき、添加で目的タンパク質の塩強度分離が良好なら、あえてその条件をいじる必要はないかと思います。 洗浄の件で、状況から想像するに、酸塩基に弱いＧＥ社のアガロースベース担体を使用されていませんか？当方では、１ｓｔカラムは汚れを前提に、工業用途を意識した、東ソーやバイオラッドのイオン交換体を使っています。酸・アルカリでごしごし洗うことができます。それぞれ、小型・大型のプレパックカラムもでているはず。 私が最初に教えを乞うたボスはもっとラジカルな考え方で、初段階精製の担体は使い捨てにしていました。安価な担体、具体的にはＤＥＡＥセルロースを使うのがポイントです。分離能は値段相応ですが、、、。

(無題) 削除/引用 No.2683-6 - 2010/06/05 (土) 09:07:24 - ザンギ >DEAEのカラムで同様のバッファーで塩濃度を変えてstepで溶出 ここでの塩濃度はNaClですね？ カラムの平衡化はどうしてるんですか。 普通は平衡化バッファーとサンプルのバッファーは同じ組成にすると思います。 違う組成になってる場合にはカラムに適したものに置き換えます。 そうしないとカラムクロマトの再現性が出せないので。 こちらが参考になるかも http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/faq/chm/iex.asp それから、これもよく分からない。 >電気泳動で確認すると シングルフラクションに溶出されるということ？

(無題) 削除/引用 No.2683-5 - 2010/06/04 (金) 18:59:19 - 蜜柑 酸塩基を使ったカラムの洗浄は”最終手段”と教授に言われています… 以前は封入カラムのHigh Qを使って精製を行っていて、詰まったときにNaOHで洗浄したのですが、2、3回使うとまた駄目になってしまい、オープンカラムに切り替えた経緯があります。 カラムのケアとはいえ、酸塩基で洗浄しすぎるのはあまり担体に良くはないですよね？

(無題) 削除/引用 No.2683-4 - 2010/06/04 (金) 18:47:38 - 蜜柑 分かりにくかったですよね、すみません… サンプルは20mM Tris/HCl, 50mM NaCl, 100mM Glycine pH7.5のバッファーに溶けており、DEAEのカラムで同様のバッファーで塩濃度を変えてstepで溶出しています。グリシンが入っていないバッファーで溶出した時と比べて、電気泳動で確認するとタンパク質のバンドが綺麗に分かれて分離される、という意味です。

(無題) 削除/引用 No.2683-3 - 2010/06/04 (金) 18:45:29 - Ｇ洗浄のアリア 普通に高濃度塩で洗浄→塩酸で洗浄→水、適当なバッファで洗浄ではダメですか？

(無題) 削除/引用 No.2683-2 - 2010/06/04 (金) 16:57:31 - ザンギ >サンプルはバッファーにグリシンを加えることで分離がきれいにでき、論文でもそのように記述されている この部分の状況がよくわかりません。 ここでの「分離」はDEAEのことでしょうか？ 普通は前段処理の後に透析などで適切なバッファーに置換をします。

陰イオン交換カラムにグリシン？ 削除/引用 No.2683-1 - 2010/06/04 (金) 13:23:11 - 蜜柑 いつも拝見させて頂いております。 タンパク質の精製で、最初の段階であるイオン交換カラムを用いての分離についての質問です。基本的なことかもしれませんが、どなたか対処法をご存知であれば教えて頂けると幸いです。 陰イオン交換カラム(DEAE、オープンカラム）に、トリスにグリシンを加えたバッファーでタンパク質を分離しています。グリシンを加えると陰イオンのカラムに吸着してしまい、カラムが詰ってしまう事態が起きています。しかし、サンプルはバッファーにグリシンを加えることで分離がきれいにでき、論文でもそのように記述されているため、やむを得ない…という状態が続いています。(使用しているカラムは同じです) しかし時間を置いてカラムを使おうと思ったらゲルがドロドロの状態になっていて、6M Ureaで洗っても解消されませんでした。(おそらくサンプル中の糖とグリシンのせいかと思うのですが…) できればグリシンを入れたバッファーで精製を続けたいです。 そこで、 ・カラムから糖を抜く方法、洗う方法 ・仮に洗う方法があったとして、封入カラムを使って大丈夫かどうか ・そもそも陰イオン交換カラムにグリシンを加えることが間違っているのか を教えて頂けますでしょうか。

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