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(無題) 削除/引用 No.2677-3 - 2010/06/04 (金) 00:43:24 - 名無し 一度きれいな結果が出ているので、それがその分子のその実験系の中での本当の姿だろうと思います。再現出来ない原因ですが、実験に使った細胞のlysateの蛋白質濃度は、うまくいった実験のときと同じ濃度にきちんと合わせているでしょうか。単に細胞数とかで見積もってるだけでしょうか。分子間相互作用ということなので、蛋白質濃度はかなり重要な因子とおもいます。特にATP濃度やSH基はじめ厳密に制御された細胞内環境とは異なり、lysate中の反応なので、蛋白質にとってかなり特異な人工的環境ですから、ちょっとしたことでいろんな非特異的なインターラクションも起こりやすいと思います。 何か別の適当な架橋剤を使って、生きた細胞内でのin vivo クロスリンキングも試みたほうがいいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2677-2 - 2010/06/03 (木) 12:44:35 - ぽん クロスリンカーが失活している可能性はいかがでしょうか？ あるいは、一度だけ成功したというときには、2-MEの効きが悪くて、ジスルフィド結合を介して多量体が出来ていたが、今は、2-MEの効きがよくて、多量体形成が、その実験条件では見られない、という可能性もあるかもしれません。 あと、boilすると、非特異的にaggregationが起こる可能性がありそうなのですが、そのあたりはいかがでしょうか。 monomerも消えているのなら、抗体（一次、二次）の失活や、対象タンパク質の発現量が少なくなっている、などの可能性も検討する必要があるかもしれません。

重合化蛋白のWBがうまくいきません 削除/引用 No.2677-1 - 2010/06/03 (木) 08:53:10 - Hero 細胞内で刺激を加えた後にある蛋白が重合化していることをWBにて検出したいと考えています。方法論は論文もある程度存在しており、細胞のlysateにBMH 5mM,BS3 5mMを投与してRTで30分置いた後、100mMTris/HClを投与してRTで15min置くことでquenching行います。その後通常のsample buffer（2-ME入り）を投与してboilしWBに使用しています。過去に一度だけ成功してきれいにdimer,trimer,tetramerが検出できたのですが、最近また行うと、現像してみたらなぜかtrimer付近以上位からスメア上になってり、バンドが見えません。また、dimer付近にも強いsubbandが出てdimerの存在も判然としません。さらになぜかmonomerも消失してしまっている有様です。クロスリンカーが強すぎて非特異的に重合化してしまっているのかと考え、BMHの濃度を振ってみたのですが、あまり変化を認めませんでした。漠然としておりわかりにくいかもしれませんが、過去にこのような経験をお持ちの方、解決策をご存知の方がおられましたらアドバイスをいただけないでしょうか。よろしくお願いします。

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