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(無題) 削除/引用 No.2676-8 - 2010/06/05 (土) 13:50:40 - TT PPさん、とても貴重な情報ありがとうございます。 > ForwardとReverse primerのpre-mixを作ってある程度長時間放置すると、 > 最初はprimer dimerが見られなかったペアでも、2割くらいはdimerが現れるようになったように記憶しています。 > また、その場合pre-mixに熱をかけた後に氷中で急冷すると、ある程度改善されたと思います。 配列にもよるのでしょうが、やはりprimerどうしの結合は通常の取り扱い温度でも容易にできるのですね。 Real-time PCRでは、プライマーとプローブのミックスを作り、小分けして1回毎に使い捨てをしていますが、マルチプレックスで混合する手間を抜く場合もこのような方法でないとだめなわけですね。 ウイルスの型別で、型別用プライマーを６種類混合して、2nd PCRで使用していましたが、その際、どうもうまくPCRがかからない場合もあったりしました。陽性検体で、2ndなので、相当濃くバンドが出るはずなのに、薄くしか出ない場合があり、ミスマッチの他に、これも原因と考えられます。

(無題) 削除/引用 No.2676-7 - 2010/06/05 (土) 09:34:37 - PP 昔、試験の都合で1000組くらいPCRを試してみたのですが、 ForwardとReverse primerのpre-mixを作ってある程度長時間放置すると、 最初はprimer dimerが見られなかったペアでも、2割くらいはdimerが現れるようになったように記憶しています。 （試験目的に沿ったprimer setなので偏りがあると思いますが） また、その場合pre-mixに熱をかけた後に氷中で急冷すると、ある程度改善されたと思います。

(無題) 削除/引用 No.2676-6 - 2010/06/05 (土) 00:02:47 - TT みんさんご回答ありがとうございます。 ああああさんのおっしゃるとおり、新旧のプライマーmixと個別でのテストをやってみます。 RealTimeさんが言われているように、解離する前にエクステンションすることも想定できますね。どうも、プライマーダイマーの量が増えているように思えるのです。 ホットスタートの酵素で試してみるといいかもしれませんね。 使用のプライマーは、50uMでいつも凍結融解していました。支障はなかったのですが、ザンギさんの言われるようにTEで冷蔵でも可能なのですね。頻繁に使用するプライマーは、冷蔵のほうが溶かす時間も不要で、いいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2676-5 - 2010/06/04 (金) 09:17:27 - ばいや ああああさんの言う通りと思います。 新旧のプライマーmixと個別でのテストするほうが早いです。 トータルのプライマー濃度が高いのでは？その濃度で行ったことがないのではっきりとはいえませんが。 凍結融解でそんなに早く影響が出るとは考えにくいです。

(無題) 削除/引用 No.2676-4 - 2010/06/03 (木) 15:26:43 - Real-time ホットスタートであっても抗体による場合、プライマーが完全解離する前にエクステンションをしてしまう場合があります。ホットスタートでなければ、プライマーダイマーの形成はより大きくなるでしょう。凍結融解は数回以内にとどめておいた方がいいと思います。 便乗質問です。凍結融解の影響を避けるため、私はプライマーの高濃度溶液にグリセロールを加え−20度保存しています。いまのところシーケンスやＰＣＲ効率に問題は出ていませんが、もし悪影響がでるとしたらどのようなことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2676-3 - 2010/06/03 (木) 14:42:11 - ザンギ プライマーの凍結融解はよくないですよ。 100μMのTE溶液なら4度保存で数年間は大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.2676-2 - 2010/06/03 (木) 06:04:48 - ああああ プライマー間にホモロジーがあるかどうかしだいではないですか。 希釈したプライマーの保存は、一回使ったら一ヶ月以上使わないとかであれば凍結保存でいいと思いますが、頻繁に使うのであれば4度保存でいいと思います。 凍結融解を繰り返すより安全です。 あれこれ考えるより、同じテンプレートでプライマーを１つづつ添加したものと、今使っているプライマーmixtureと新しく調製したプライマーmixtureでPCRをかけて比較するだけで解決すると思いませんか。

プライマーのプレミックス 削除/引用 No.2676-1 - 2010/06/03 (木) 01:37:03 - TT PCRでウイルスの検出を行っています。 多くのターゲットを１チューブですませるため、３種類のウイルスを対象にマルチプレックスで反応を行っています。 今まで、プライマーは、PCR　mix調整時に、１つづつ添加していました。面倒なので、Forward Reverseをそれぞれ３種類、合計６種類のプライマーを混合してプレミックスを作成し、これでPCRを行ったところ、PCRがかかりにくくなりました。プライマーのプレミックスは、凍結融解を繰り返しています。 PCRの際に、denatureを94℃3分かけるので、プレミックスの際にプライマーどうしが結合しても、プライマーは解離すると思うのですが、PCRの失敗は、プライマーのプレミックスが原因でしょうか？プライマーのプレミックスは、プライマーダイマーの生成につながりますか？

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