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(無題) 削除/引用 No.2675-5 - 2010/06/24 (木) 21:43:12 - take 逆転写なのかPCR なのか？ 私の手の話ですが、SperScriptII 20ul 反応で、4ug RNAだと反応後1ul PCR (20ul rxn)でバンドが出ず、1ug RNAでは大丈夫だったことがあります。 最初のRNA 量が多いと、結果としてPCR がかかりにくいようです。

泳動してみました 削除/引用 No.2675-4 - 2010/06/23 (水) 01:27:35 - 教えて下さい ようやく時間がとれて泳動してみました。 ポジコンよりはスメアが多く見られましたが、オペ検体なので仕方ないと思っています。 28s：18sはほぼ2：1でした。RNAはちゃんととれていたので一安心！逆転写してPCRで確認。今回はきちんと増幅されました。 逆転写がうまくかからなかった理由は相変わらず不明ですが・・・ 取り敢えず出来る様になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2675-3 - 2010/06/03 (木) 00:17:24 - ぶん RNAを泳動してみては？ もちろん掛かるRNAのポジコンも忘れずに

(無題) 削除/引用 No.2675-2 - 2010/06/02 (水) 23:38:00 - ami > 吸光度計ではRNAがとれている様なのに逆転写がかからないなんて事が有るのでしょうか？ あると思います。分解したRNAも吸光度はかわりません。 > いつもは50〜100mgの組織から　OD260/280は1.9〜2.1　濃度0.3〜2μg/μℓ　total RNA量10〜50μgです。今回は回収量が多いなと喜んでいたのですが・・・1サンプルだけなら元の組織の状態が悪くRNAが壊れていたとも考えられなくもない？？のですが複数サンプルではありえない！ 最初の組織の量が多すぎるとキットがたんぱくとかを除去しきれないとかあるんじゃないでしょうか。

逆転写がかからなくなりました 削除/引用 No.2675-1 - 2010/06/02 (水) 23:31:40 - 教えて下さい ヒト組織（約100mg）からRNAを抽出（TRIzol添加、Biomasherでホモジナイズしクロロフォルムを加えて遠心、　上清を回収してEt-OH混和後GE illustre RNA spin kitを使用） 吸光度は、OD260/280は2.0〜2.13　濃度1〜3μg/μℓ　測定グラフはきれいなカーブです。 ABI RNA to cDNA kitを用いて逆転写（2μg/20μℓ）後PCR（β−actin）で確認したところ微かなバンドしか見えません。逆転写には以前同様の組織からとったRNAをポジコンにしましたが、それはきちんと増幅されていました。試薬・各kitを新しいものにして繰り返しましたが、同じ結果でした。ルーチンワークの様にRNA抽出をしていますが、こんな事は初めてです。 吸光度計ではRNAがとれている様なのに逆転写がかからないなんて事が有るのでしょうか？ いつもは50〜100mgの組織から　OD260/280は1.9〜2.1　濃度0.3〜2μg/μℓ　total RNA量10〜50μgです。今回は回収量が多いなと喜んでいたのですが・・・1サンプルだけなら元の組織の状態が悪くRNAが壊れていたとも考えられなくもない？？のですが複数サンプルではありえない！ なぜ？どうしたら良いのか教えて下さい。

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