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色々とご教示ありがとうございます． 削除/引用 No.2674-6 - 2010/06/03 (木) 19:10:05 - Hachi 「遺伝子Aの発現が上昇する」　では情報が欠落しておりすいませんでした． mRNAの発現およびタンパク質の発現が共に上昇致します． Act.Dを作用させての実験を行い，mRNA発現のlevelに差がなかったので，転写後の調節を受けてmRNA levelに差が出ているのではなく，転写段階での調節を受けて遺伝子AのmRNA levelが上昇するものと考えております． 「発現誘導する細胞株とレポーターアッセイに使った細胞とが同じでしょうか？」 →　同じ細胞株です． 「蛋白質の安定性を変化させている可能性は？」とのご指摘を頂きましたが，これについては検討しておりません． 「なぜ+203とか+22という半端な点も含んでいるんですか？なにかしらの根拠がおありでしょうか（制限酵素サイトかなにかで組み込みやすかったという落ちでしょうか）？」 とのご意見ですが，ご指摘の通り組み込みやすかったという落ちです． fishさん masaさん Pumpkinさん あべちゃんさん 貴重なご意見を頂き，ほんとうにありがとうございます． 是非参考にさせて頂いて，今後の研究を検討したいと思います． 引き続き，ご教示頂ける点がありましたら，宜しくお願い致します．

(無題) 削除/引用 No.2674-5 - 2010/06/03 (木) 14:41:51 - fish 僕が利用したのはucsdのサイトで種間での保存状況を調べる方法です。 手順としては、 プロモーター領域や1st intronで最も保存されているMost conserved regionをみる。 次に、この保存されている領域で、GRの結合配列があるかを見る。 結合配列があれば、その場所までクローニングする。 といった方法で進めました。過去に10kbp上流のエンハンサーの報告がありますが、まず重要な位置は保存されていることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.2674-4 - 2010/06/03 (木) 13:21:15 - masa 遺伝子Aの発現の上昇を確認されたのはmRNAレベルでしょうか？それともタンパク質レベルでしょうか？ タンパク質の安定性、mRNAの安定性の変化の可能性はないでしょうか？ 転写レベルで変動していると仮定すると、デキサメタゾンをリガンドとするGRの結合配列や、ＧＲと協調して働く転写因子の結合配列をサーチしてみてはどうでしょうか？核内受容体の論文の中にはかなり遠位の領域がループ構造を形成してプロモーター領域に作用するという報告もありますのでレポーターに組み込めないくらい長い領域で制御が行われている可能性もあります。 さらに領域の問題と共に内在性の遺伝子領域と、レポータープラスミドの配列のエピジェネティックな制御の違いが原因の場合があります。レポータープラスミドもヌクレオソーム構造はとりますが、内在性の遺伝子領域を完全に反映しているわけではないので、DNAのメチル化依存的な転写制御や、抑制型のヒストン修飾の解除等による発現誘導は観察が難しいとこもあります。 レポーターアッセイと並行してChIPアッセイやDNAのメチル化解析などで内在性の遺伝子領域の状態を観察してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2674-3 - 2010/06/03 (木) 12:55:12 - Pumpkin あべちゃんさんも+1から上流とおっしゃっていますが、トピ主さんはなぜ+203とか+22という半端な点も含んでいるんですか？なにかしらの根拠がおありでしょうか（制限酵素サイトかなにかで組み込みやすかったという落ちでしょうか）？

(無題) 削除/引用 No.2674-2 - 2010/06/03 (木) 09:58:03 - あべちゃん >[Re:1] Hachiさんは書きました : > 現在，ある細胞株をデキサメタゾンで刺激すると　遺伝子Aの発現が上昇するのですが，その調節領域を調べています． mRNAレベルが上昇するのですか？蛋白質レベルであるなら蛋白質の安定性を変化させている可能性は？ 発現誘導する細胞株とレポーターアッセイに使った細胞とが同じでしょうか？ 違うのであればレポーターアッセイに使う細胞でもその誘導が起こるのか？ > �@遺伝子Aの上流，どの辺りまで調べたらよいのか？-1kbとか-2kbとかまで離れた場所に調節領域があるのかどうか？ 有る可能性は否定できないです。 > �Aイントロンに調節領域があるのか？ そういう遺伝子もあります。 > 簡単に申し上げますと，転写を促進する調節領域がどこにあるのか探しているのですが，手が詰まっている状態です． 私だったら、翻訳開始点＋１から2-３ｋｂ上流までを使ってアッセイして、絞り込みます。

レポータージーンアッセイ 削除/引用 No.2674-1 - 2010/06/02 (水) 23:30:59 - Hachi 宜しくお願い致します． 現在，ある細胞株をデキサメタゾンで刺激すると　遺伝子Aの発現が上昇するのですが，その調節領域を調べています． 遺伝子Aの-802〜+22　DNA配列をpGL3L(+) vectorに組み込んで 細胞株にtransfectionしデキサメタゾンを加え，ルシフェラーゼアッセイを行ったのですが，（デキサメタゾンを加えるポイントは，いくつか検討してみました）デキサメタゾン（＋）と（−）では差がなく， 次に遺伝子Aの-2003〜+203のDNA配列をpGL4.10 vectorに組み込んだものを 同様にルシフェラーゼアッセイしましたが，これもデキサメタゾン（＋）と（−）では差がありませんでした． 今後，どの領域を調べようかと考えているのですが， 果たして，デキサメタゾンに反応して遺伝子Aの転写を調節している配列について， �@遺伝子Aの上流，どの辺りまで調べたらよいのか？-1kbとか-2kbとかまで離れた場所に調節領域があるのかどうか？ �Aイントロンに調節領域があるのか？ �B3'の下流領域に転写を促進する領域があるのか？ をお聞きしたいと思っております． 簡単に申し上げますと，転写を促進する調節領域がどこにあるのか探しているのですが，手が詰まっている状態です． 何とぞご教示いただきたく，宜しくお願い致します．

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