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(無題) 削除/引用 No.267-10 - 2009/04/06 (月) 09:46:11 - るる 記入がありませんが、活性測定の時には透析かなんかで硫安は除いているんですよね？ 65%の上清には活性がありませんか。 硫安沈殿はサンプルの状況にも結果が左右されると思います。

(無題) 削除/引用 No.267-9 - 2009/04/03 (金) 18:33:49 - み 活性を指標にされていますが、他の方法（westernなど）でどの分画に濃縮されているかを確認できないのでしょうか？ 活性だと硫安による失活も否定できない。

(無題) 削除/引用 No.267-8 - 2009/04/03 (金) 18:04:29 - nn0011nn Aさん うまく説明できずに申し訳ございません。 酵母が分泌したタンパク質を粗精製するために硫安沈殿を行っています。タンパク質は培養液の方にあり、酵母の中にあるわけではありません。 培養液に活性が見られるかを確認するため、培養液を少しだけとって遠心し、上清にバッファーと基質を加えて活性をみたところ、活性が確認されました。 活性が見られたので残りの培養液を遠心して酵母を沈殿させ、上清を回収しました。次に、35％で硫安沈殿をして上清を回収し、次に65％で硫安沈殿をすると目的のタンパク質が沈殿のほうに見られると思い実験を行いました。（類似のタンパク質がこの２つの濃度でタンパク質を沈殿させて精製しているため）しかし、35％の上清・沈殿の双方にて活性が見られませんでした。そのため、実験方法に問題があったのかと思いました。 硫安沈殿の前に酵母を遠心して取り除こうと思ったのは培養液の粘性が高かったので硫安沈殿の前に取り除いたほうがいいのかと思い遠心しました。

(無題) 削除/引用 No.267-7 - 2009/04/03 (金) 16:42:20 - A nn0011nn さん > 培養液の粘性が高いので遠心して酵母を落としてから硫安を35％で計算して加え、４℃で1日スターラーで攪拌し、次の日に15000×gで30分遠心したところ、活性が見られませんでした。 > 先輩に「酵母を遠心で落としてから硫安沈殿したらいいですか？」と聞いたら、「そのまま培養液を硫安で落として」と言われました。タンパク質濃度が低い場合はそのまま硫安沈殿で落としたほうが良かったってことでしょうか？それとも何か操作にまずいところがあったのでしょうか・・・ 酵母を含んだままの溶液を35％硫安で沈殿したということですか？ 沈殿したタンパク質を回収するのかと思っていたのですがもしか したら粗精製として培養液中に混在している他のタンパク質を硫安 沈殿によって除き、培養上清を回収するのですか？酵母を除かないで 沈殿を行なうということはそう解釈するしかないのですが。目的 タンパク質が沈殿にあるとしたら酵母菌と共存しているはずです。 酵素活性が見られないとのことですがどの様なコントロールを取っている のですか？少なくとも沈殿前の培養上清に活性があることは確認している と思いますが、硫安によって酵素活性が阻害されるかどうか確認して いますか？ ここに書かれた情報だけでは硫安沈殿の目的、酵素活性測定の コントロールなど状況がはっきりしませんから正しいアドバイス をするのは難しいですね。 また文章を読んだ印象ですから勘違いかもしれませんが > 先輩に「酵母を遠心で落としてから硫安沈殿したらいいですか？」 > と聞いたら、「そのまま培養液を硫安で落として」と言われました。 の部分を読むと自分で今何をやっているのか理解せずにとりあえず 先輩に言われるままに実験をしているように聞こえます。 硫安沈殿を行なうのであればその理論を自分でも調べてある程度理解し、 その上で疑問があるのであればその先輩とディスカッションしてから 実験するべきでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.267-6 - 2009/04/03 (金) 15:29:19 - nn0011nn 培養液の粘性が高いので遠心して酵母を落としてから硫安を35％で計算して加え、４℃で1日スターラーで攪拌し、次の日に15000×gで30分遠心したところ、活性が見られませんでした。 先輩に「酵母を遠心で落としてから硫安沈殿したらいいですか？」と聞いたら、「そのまま培養液を硫安で落として」と言われました。タンパク質濃度が低い場合はそのまま硫安沈殿で落としたほうが良かったってことでしょうか？それとも何か操作にまずいところがあったのでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.267-5 - 2009/04/02 (木) 19:23:09 - 名無し あくまでも一般論ですが蛋白質を取り扱う方法のなかでは、硫安沈殿法は蛋白質へのダメージが少ない方法と思います。だから精製などで生物活性を維持したいときにもよく使われます。最近は買わないのでわかりませんが、昔は酵素などはよく硫安けんだく液の状態で売ってましたし、むしろ保護的に働くこともあると聞いたことがあります。動物細胞の無血清培養上清からの精製で硫安分画したことがありますが、そのときは一晩４Cにおいてから遠心したら一応蛋白質は沈殿してました。比活性は大してあがりませんがクロマトなどと比べて活性の回収率はとてもよかったです。

(無題) 削除/引用 No.267-4 - 2009/04/02 (木) 16:45:21 - A 一般的に硫安沈殿を行なう場合、溶液中の総タンパク質濃度が最低でも0.1mg/mLはないと有効な沈殿は出来ません。酵母の抽出液なら問題ない と思いますが培養上清を硫安沈殿する場合おそらくタンパク質濃度 がこの最低レベルにもたっしていないのではないでしょうか。Bradford なりBCA法などで総タンパク質量を正確に測定出来ればいいのですが 培養上清には多量のアミノ酸が含まれているでしょうから正確な タンパク質量を測定するのは難しいかと思います。ですからこの場合 硫安沈殿の前にAmiconのstirrer cellなどを使って限外ろ過法で濃縮 する必要がでてくると思います。ただ、もし硫安沈殿の目的がサンプルの 濃縮のみなら硫安沈殿の意味がなくなりますね。硫安により目的タンパク質 が変性する危険が増えるだけですから。 タンパク質濃度が薄く体積がそれほど大きくない場合は硫安が多少 もったいないのですが以下のような方法があります。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo12.html

(無題) 削除/引用 No.267-3 - 2009/04/02 (木) 15:18:16 - 名無し 発現させた蛋白質が培地中に分泌されるものならば、遠心して上清を回収してそれに硫安粉末を投入してスターラーをゆっくり回しながら溶かします。加える量は何％飽和度（普通の重量％とちがう。）にするかによります。サンプルの液量と希望する飽和濃度から何ｇ入れればよいか、すこし昔の詳しめの生化学の実験書に換算表が出ていると思いますのでそれを使えば簡単です。また別に計算法もあるとおもいました。固体でなくて硫安溶液を加える方法もありますが液量が増すのであまりやりません。硫安がとけたらスターラーを止めて４Cまたは氷中に数時間おきます。培養上清のように蛋白質濃度が低いものは沈殿形成にけっこう時間がかかるので、低温室に一晩静置するなどすることもあります。 発現蛋白質が細胞内にあるならば酵母を回収して適切な方法で細胞を破砕して蛋白質を抽出し、その抽出液に上記の要領で硫安を加えます。動物培養細胞や組織と違い、酵母は容易には壊れませんので、蛋白質がちゃんと抽出できているか、蛋白質の活性を見るような場合は破砕方法が蛋白質にとってダメージはないか、などにも注意した方がよいでしょう。 蛋白質の沈殿を適当なbufferに溶かしてから、おなじbufferに透析して硫安濃度を下げていけば再び溶けます。 （２）の沈殿は硫安沈殿させた蛋白質ですか、それとも酵母ですか。

(無題) 削除/引用 No.267-2 - 2009/04/02 (木) 14:53:25 - n0010 �Aに関しては、おそらく大丈夫だと思いますが不安でしたら少量で凍結・解凍に耐えられるのかテストしてみてはどうでしょうか。

硫安沈殿 削除/引用 No.267-1 - 2009/04/02 (木) 11:48:22 - nn0011nn 今度、酵母で発現させたタンパク質を硫安沈殿で粗分画しようと思うのですが、いくつか分からない点がありますので質問なのですが・・・ �@培養液に直接硫安を加えて遠心にかけるのか、それとも培養液をまず遠心して酵母を沈殿させ回収した上清に硫安を加えるのでしょうか？ �A遠心後の沈殿を遠沈管ごとそんまま保存する場合、−80℃でストックしておけばよいのでしょうか？

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