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(無題) 削除/引用 No.2664-22 - 2010/06/05 (土) 16:50:46 - ats > いちお、lacZのATGの上流10bpほどに、AGGというリボソーム結合サイトがあるのですが、AGGでもなんとかワークしそうですね。 lacZはもともと大腸菌の遺伝子だから、改変していないオリジナルのSD配列でしょう。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2664-21 - 2010/06/05 (土) 12:21:29 - ベクター設計初心者 ＞みみさん、atsさん いちお、lacZのATGの上流10bpほどに、AGGというリボソーム結合サイトがあるのですが、AGGでもなんとかワークしそうですね。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2664-20 - 2010/06/05 (土) 12:17:10 - ベクター設計初心者

(無題) 削除/引用 No.2664-19 - 2010/06/04 (金) 18:49:11 - みみ 確かにGFPの上流にShine-Dalgarno配列が無いですね>pAcGFP1 何も考えずにMCSにHisタグを突っ込むのが無難な気がしてきました。 むしろHisタグ用のベクターにGFPを入れる方が楽ってことは無いかなぁ...。

Shine-Dalgarno配列 削除/引用 No.2664-18 - 2010/06/04 (金) 09:01:03 - ats 大腸菌の翻訳開始には、ATG(GTG)のおおよそ4~10bp上流にShine-Dalgarno（SD）配列（AGGAGGAの一部、AGGでも程度の差はあれ機能する）が必要です。 ベクター配列を見ていませんが、EGFPのATGは大腸菌の翻訳開始部位にはならないかも。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2664-17 - 2010/06/03 (木) 15:59:35 - ベクター設計初心者 >ああああさん、みみさん ありがとうございます。 >GFPの開始コドンを残して，そこから読まれる産物が多少出来ても，Niカラムにくっつかないから関係ないでしょ？ おっしゃる通りです。 御回答してくださった皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2664-16 - 2010/06/03 (木) 11:16:25 - みみ それについては774さんが初めに答えています。GFPの開始コドンは抜かなくても良いし，気になるなら抜けば良い。要は「挿入するHisタグの上流にインフレームの開始コドンがあれば良い」，ただそれだけです。そのATGがLacZのものだろうが，GFPのものだろうが，無理矢理インサートしたものだろうがなんでも良いです。 GFPの開始コドンを残して，そこから読まれる産物が多少出来ても，Niカラムにくっつかないから関係ないでしょ？

(無題) 削除/引用 No.2664-15 - 2010/06/03 (木) 05:44:50 - ああああ AcGFPの開始コドンは抜く必要ありません。 クロンテックなどで売られてるその他のC末タグ用のプラスミドなどもすべてタグに開始コドンが入っていますよ。確認してください。 そもそも、pAcGFP1は大腸菌内でlacプロモーターからlacZとAcGFPの融合タンパクを発現するプラスミドですよね。 lacZの開始コドンにフレームを合わせてHisタグの配列を挿入すれば、まず間違いなく発現するはずです。 クロンテックのVector Informationに全て書いてありますよね。一般的な話の前に、ご自分で使うプラスミドのことをもっと調べた方がいいのではないでしょうか。

やっぱり一つ質問させて下さい 削除/引用 No.2664-14 - 2010/06/03 (木) 02:36:19 - ベクター設計初心者 ATG-<GFP>-STOPのN末にHisを入れるときは、 ATG-<His>-<GFP>-STOP のように、GFPについているATGは消した方がいいのでしょうか。 もしくは、 <His>-ATG-<GFP>-STOPのように、<His>を導入させるだけでいいのでしょうか？

ご迷惑をおかけしました。 削除/引用 No.2664-13 - 2010/06/02 (水) 21:22:14 - ベクター設計初心者 ＞in situさん、Pumpkinさん、774さん ご迷惑をおかけしました。 自分で勉強して解決したいと思います。 実験を始めたばかりでまだ要領が分かっていませんでした。 論文はたくさん読んでいるのですが、確かに教科書や参考書も大切ですね。 すみませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2664-12 - 2010/06/02 (水) 20:37:25 - 774 ＞最後に、lacZのストップコドンが、EGFPのストップコドンまで存在しないのですが、やはり融合した状態で発現されるのでしょうかね。 材料と方法がわからないので答えにくいですが、結局は向きとフレーム次第でしょう。 どのようなｍRNAが合成され、それからどのようなタンパク合成が起きるかを考えてください。 もしわからなければ、in situさんのアドバイスにもあるように教科書・実験マニュアル類で調べるのがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2664-11 - 2010/06/02 (水) 20:32:20 - Pumpkin 厳しく行きますが、 in situさんの書き込みに関しては、無視でしょうか。その書き込みこそがトピ主さんにとっても、ベクタ構築にとっても最優先事項ですよ。 自分に都合の良い解釈だけを探しては、研究を見失いますよ。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2664-10 - 2010/06/02 (水) 20:19:01 - ベクター設計初心者 >レフトさん Hisタグの開始コドンとはどういう意味でしょうか？ 単に、MCSにHisタグの配列を組み込むだけではGFPと融合されて発現しないのでしょうか？ ATG<His6>を導入しないとだめなのですか？ 使用しているベクターは、pAcGFP1です。 >「最後に、lacZのストップコドンが、EGFPのストップコドンまで存在しないのですが、やはり融合した状態で発現されるのでしょうかね。」この一文は意味不明です。 lacZのスタートコドンはあるのですが、STOPコドンが明記されていないので・・・。EGFPのストップコドンまで読まれるのかと考えたのですが。

(無題) 削除/引用 No.2664-9 - 2010/06/02 (水) 19:48:07 - in situ 最近、ベクターコンストラクトの質問が多いですが、この類の質問はしっかり遺伝子工学の基礎が分かっていないと、その場しのぎで質問しても次から次に疑問が出てきます。 まずは、しっかりと教官と話して、転写・翻訳に関する知識を確認して、基礎を身につけましょう。 羊土社・秀潤社などから遺伝子工学のハウツー本も数多く出ています。 読みましょう。 Molecular Cloningなどの古典的な教科書も役に立ちます。 研究室もしくは図書館で目を通して見るとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2664-8 - 2010/06/02 (水) 19:04:52 - レフト えーと、ご質問が要領を得ないから誰も答えられないんでは？ EGFPの入ってるベクターの構造がどうなってるか、お書きになった情報では曖昧でよく分かりません。広く出回ってるベクターならプラスミド名をお書きになった方が話が早いですよ。 774さんの書いておられるのは、Hisタグ-EGFPを発現したいならEGFPがわに開始コドンが残っていてもHisタグの開始コドンから翻訳されるということです。 スペーサーが必要かどうかは目的によりけりです。 「最後に、lacZのストップコドンが、EGFPのストップコドンまで存在しないのですが、やはり融合した状態で発現されるのでしょうかね。」この一文は意味不明です。

誰かお願いします。 削除/引用 No.2664-7 - 2010/06/02 (水) 18:42:58 - ベクター設計初心者 誰かお願いします。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2664-5 - 2010/06/01 (火) 18:59:02 - ベクター設計初心者 ＞774さん タグの開始コドンという表記がありますが、これはlacZの開始コドンと考えてよろしいいでしょうか？ あと、タグとEGFPの距離とありますが、その間のアミノ酸は結果的にスペーさの役割も果たすと考えてもよろしいでしょうか？ タグとEGFPの間にGlyを５個ほどスペーサートして導入する予定だったので。 最後に、lacZのストップコドンが、EGFPのストップコドンまで存在しないのですが、やはり融合した状態で発現されるのでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.2664-4 - 2010/06/01 (火) 18:06:45 - 774 僕の経験では、N末端にタグを付ける時に目的タンパク（今回はEGFP）の開始コドンが存在しても、タグ付きタンパクとして発現されてます。 なので、HisタグとEGFPのフレームさえあっていれば、EGFPの開始コドンが残っていても融合タンパクとして発現されると考えてよいと思います。 ひょっとするとタグの開始コドンとEGFPの開始コドンまでの長さによってはEGFP単独で発現するかもしれませんが・・・

追加２ 削除/引用 No.2664-3 - 2010/06/01 (火) 18:03:25 - ベクター設計初心者 大腸菌で発現させて精製する予定です。

追加 削除/引用 No.2664-2 - 2010/06/01 (火) 17:08:18 - ベクター設計初心者 EGFPのN末端はマルチクローニングサイトになっていまして、その上流にlacZの開始コドンがあります。

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