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(無題) 削除/引用 No.2662-7 - 2010/06/05 (土) 18:21:13 - 名無し 高次構造形成に起因するsteric な問題でHisタグが隠れてしまっていることが原因ならば、生物活性のある蛋白質を精製する必要がないならば、6xHis/Ni-affinity 精製で使用できる8M Ureまたは6M Gdn-HCl存在下での変性条件で精製すればたぶんいけます。（ケースバイケースですが）ゆっくり透析して変性剤を除けばrefoldingして活性が再生できる場合もあります。 上述のような問題が原因ならばtagを変えても改善しないかもしれません。少し大きなタグにするとよいかもしれません。つける場所を変えてみるのはよいかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.2662-6 - 2010/06/04 (金) 11:04:10 - 大将 回収率が低い 原因１→吸着不良（FT画分に流れてしまっている） 原因２→溶出不良（溶出イミダゾール濃度は適当ではない） ちなみに精製度不良のときは、吸着条件（バッファーのイオン強度を上げると、非特異な吸着が起こりにくくなり、結果、精製度が向上することがある）の検討をするとよいという経験有

(無題) 削除/引用 No.2662-5 - 2010/06/02 (水) 19:16:38 - レフト foldingの結果によるstericな障害で収率が落ちているとすれば、His-tagを別のものに代えても改善が見られる可能性は薄いのではないでしょうか。 結合がまるで見られなくなるわけでないとすれば、His-tagへのaccessibilityは無い方に傾いた平衡にあるのでしょうから、結合に十分長い時間を取れば収率は上がるのではないかと思いますが如何？

(無題) 削除/引用 No.2662-4 - 2010/06/02 (水) 11:54:53 - はらへった 20Lぐらい培養するとか。

(無題) 削除/引用 No.2662-3 - 2010/06/02 (水) 11:21:39 - ぶん どの段階が回収率を下げているのかは確認済みですか？ 吸着の段階か溶出の段階か等

(無題) 削除/引用 No.2662-2 - 2010/06/02 (水) 10:30:13 - 融合 スペーサーをタグとの間にいれるか、N末融合なら、C末に融合させるのはどうでしょう？？ スペーサーを入れるのは、MBPなどで聞きますが、この場合はタグが小さいので、どれだけ効果あるかは疑問ですが、、、。 >HN-tag、HAT-tag等の使用を考慮するべきでしょうか？ HN-tag、HAT-tagってなんですか？

His-tag精製 回収率 削除/引用 No.2662-1 - 2010/06/01 (火) 09:24:05 - imp いつもお世話になっています。 あるタンパク質のHis-tag精製を試みているのですが、回収率が低く困っています。 他のHis-tag融合タンパク質を使用した場合、ほぼ100%回収できるので実験手法自体に特別な間違いはないと思います。 この様な場合、まずどの様な条件検討をするべきでしょうか？ 精製用のBufferで目的タンパクが可溶しているのは確認済みです。 BindingはBatch法で行い、カラムに移した後結合しなかったタンパク質を再度カラムに通しています。 His-tagがFoldingの際に内側に入って収量が低くなる事があると良く聞くので、やはりHN-tag、HAT-tag等の使用を考慮するべきでしょうか？ よろしくお願いします。

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